籽粒苋PEPC启动子功能研究和PPDK基因密码子分析

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籽粒苋是双子叶苋科苋属一年生草本植物。依照光合途径,籽粒苋属于C4植物。本试验室先前已从籽粒苋中克隆了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因和丙酮酸磷酸二激酶(PPDK)基因这2个C4途径关键酶基因,并获取了它们上游的启动子序列。本研究对这2个启动子的功能进行了研究,以期为这2个启动子在植物转基因中的应用奠定基础。本研究还对籽粒苋丙酮酸磷酸二激酶(PPDK)基因的密码子偏好性进行了研究,以期为该基因用于植物遗传改良提供依据。  本研究主要内容包括:⑴构建了3个PEPC启动子,分别是5′端未缺失、缺失600bp和缺失1200bp。用这3个启动子分别替换植物表达载体 pCAMBIA3301上 GUS基因上游的CaMV35S启动子,导入农杆菌LBA4404。用农杆菌与烟草叶盘共培养,之后检测GUS基因的瞬时表达情况。结果初步表明,这3个启动子均能驱动GUS基因在烟草叶片中瞬时表达;⑵将PPDK启动子替换pCAMBIA3301上GUS基因上游的 CaMV35S启动子,导入农杆菌LBA4404。用农杆菌与烟草叶盘共培养,之后检测GUS基因的瞬时表达情况。结果初步表明,该启动子能驱动GUS基因在烟草叶片中瞬时表达;⑶获得了PEPC启动子1200bp及PPDK启动子的转基因烟草植株。对转基因烟草幼苗叶片进行 GUS组织化学染色分析,结果表明,这些启动子均能驱动 GUS基因表达,不同启动子的差异不显著。在光照条件下,似乎表达量有所提高,但差异不显著;⑷运用CHIPS、CUSP和CodonW等程序分析了PPDK基因的密码子偏好性,研究结果表明,该基因偏好于以A或T结尾的密码子,与其它几种被比较的双子叶作物的PPDK基因密码子偏好性趋势一致。基于PPDK基因密码子使用偏性的系统聚类分析表明,籽粒苋与马铃薯、苜蓿等双子叶植物聚为1类,而单子叶植物稗草、玉米和高粱等聚为1类,与系统进化地位一致。但单子叶植物水稻的密码子偏好性则与籽粒苋较为相近,而与玉米、高粱较远。上述结果似乎预示籽粒苋 PPDK基因适合导入马铃薯等双子叶植物,也较为适合导入单子叶植物水稻。为了选择合适的蛋白质表达系统,比较、分析了籽粒苋PPDK基因的密码子偏好性与大肠杆菌和酵母菌的异同,发现与酵母菌的差异小于大肠杆菌,表明选择酵母表达系统较为合适。
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