微管广泛存在于真核细胞的胞质内,是由αβ两种微管蛋白聚合而成的管状聚合物。作为构成细胞骨架的主要成分之一,微管在维持细胞形态,参与细胞的收缩和胞质内物质的运输等方面发挥着重要的作用。尤其是其在细胞分裂前期解聚重组形成纺锤体参与到细胞有丝分裂中的这一特殊的生物学功能使之成为抗肿瘤药物的重要靶点。肿瘤细胞具有快速增殖的能力,若抑制其纺锤体的形成,必将影响细胞有丝分裂的正常进行,使得肿瘤细胞生长停滞于G2/M期。二十世纪初以微管为靶点的紫杉醇类药物在临床上的成功应用激起了人们寻找和改造新型微管类靶点药物的浓厚兴趣。尽管人们对紫杉醇不断地进行结构改造和修饰但其水溶性差,易产生多药耐药以及毒副作用强等问题还是限制了其临床上的广泛运用。寻找新型的微管靶点药物一直是抗肿瘤药物学领域研究的热点之一,直到1987年美国国家癌症研究所Pettit等从南非矮生柳树(Combretum caffrum)中发现了天然活性产物combretastatin A-4(CA-4)。作为经典的微管聚合抑制剂秋水仙碱的类似物,CA-4还具有较强的破坏肿瘤血管的作用。因而与传统的微管类药物相比,CA-4具有抗癌效果强,不易产生耐药等诸多优点,而且由于其结构新颖,便于改造和修饰,颇受药物研究者的青睐。然而随着CA-4临床试验的深入,人们发现CA-4虽然能导致肿瘤细胞的大量坏死,但对残存的肿瘤组织的杀伤力较弱,因而常导致化疗的失败。本论文的研究旨在寻找一些新的CA-4的衍生物以及开发CA-4的临床应用潜能,探索常规的化疗药物或是临床一线用药与CA-4合理的联合用药方案,以期通过以上两方面的研究达到减少用药量,增强药物疗效并减轻化疗药物的毒副作用的最佳治疗效果。同时对限制CA-4抗肿瘤疗效的分子机制做了进一步的研究,希望能为制定该类化合物临床治疗策略提供全新的思路。本论文将主要分为以下三个部分：(1)对经过结构改造和修饰得到的一系列CA-4衍生物进行抗肿瘤活性的筛选以及相应的药效学评价,并对从中得到的抗肿瘤活性较好,并且毒副作用较低的候选化合物进行初步分子机制的研究。(2)寻找合理的联合配伍用药方案,将不同作用机制的抗肿瘤药物与CA-4合用,以期达到减少药物用量,提高疗效,减轻化疗药物的毒副作用的最佳效果。并进一步探讨两药合用的分子机制,力求为设计临床联合治疗方案提供新的方向。(3)为进一步推动CA-4的临床应用,解决其不能有效抑制化疗后残存的肿瘤细胞增殖的现象,我们对其抗肿瘤机制做了深入的研究,希望通过寻找限制CA-4抗肿瘤疗效的分子机制,采取相应的措施有针对性的进行克服。第一部分Combretastatin A-4衍生物的抗肿瘤活性及其机制的研究目的：作为新型的微管聚合抑制剂,CA-4由于其结构简单,抗癌活性显著,因而备受药物化学家的关注。为进一步提高其疗效,降低毒性,我们通过对一系列经过修饰的CA-4衍生物抗癌活性的筛选,旨在寻找具有广谱抗肿瘤活性的新型CA-4类化合物。方法和结果：XN05是一个新合成的Combretastatin A-4的类似物。首先我们通过MTT法在六株不同组织来源的人肿瘤细胞上(SGC、PC-3、ECA、MCF-7A2780和A549)对XN05的抗肿瘤活性进行细胞水平检测。结果显示其具有较强的抗肿瘤活性,IC5o值均小于2μM,而在两株肝癌细胞BEL-7402和SMMC-7721上的抗肿瘤活性比CA-4更强。值得注意的是,在正常的肝实质细胞HL-7702上XN05的IC50值要明显高于CA-4,提示我们该化合物对正常组织来源的细胞杀伤作用相对较弱。进一步通过离体的微管蛋白聚合实验和免疫荧光实验的结果证实XN05也是以微管为靶点发挥其抗肿瘤活性,并且XN05抑制微管聚合的能力与其母体CA-4类似。引起细胞G2/M期阻滞是微管类药物的重要特征之一,运用流式细胞术在经过XN05处理的两株肝癌细胞中均能观察到明显的G2/M期细胞周期阻滞现象,并且该现象存在浓度和时间依赖性。Western blot结果显示XN05引起的G2/M期阻滞现象也可能与细胞周期关键蛋白cdc2, CDK7以及cyclin B1的表达发生异常有关。随着药物作用时间的延长我们发现处于G2/M期阻滞的细胞最终走向了细胞的凋亡,进一步地肿瘤细胞的生长受到了抑制。结论：本研究表明经过结构修饰的新型CA-4衍生物XN05具有明确的作用靶点,通过抑制微管的聚合使得细胞阻滞在G2/M期,并最终导致细胞走向凋亡发挥其抗肿瘤活性。此外,我们还发现XN05作用于BEL-7402和SMMC-7721肝癌细胞后引起的不同程度细胞周期阻滞可能与XN05能够对不同的周期蛋白(Cyclins)及周期蛋白依赖性激酶(CDKs)的表达产生影响相关。XN05在体外有着广谱,且优于同系列化合物的抗肿瘤活性,尤其是其在肝癌细胞株中表现出的细胞毒特异性使其非常有希望成为临床治疗的新型抗肿瘤微管类化合物。第二部分Combretastatin A-4与化疗药物联合用药的抗肿瘤活性评价及机制的研究目的：随着对CA-4抗肿瘤活性研究的深入,人们发现CA-4还是作用于肿瘤血管的靶向药物。据报道,CA-4在无细胞毒浓度下,作用一定时间后不但能明显地抑制新生血管的生成而且还能破坏即成的血管官腔,造成肿瘤内部大面积的坏死。但是CA-4对肿瘤的增殖抑制只限于其内部,对于肿瘤边缘血管较丰富区域的细胞增殖没有明显的抑制作用,因而常导致临床上治疗的失败。所幸的是,肿瘤边缘血管丰富区域的细胞对传统的放疗化疗方式较敏感,这就提示了我们CA-4具有联合用药的潜力和优势。本实验的研究旨在寻找不同作用机制的传统化疗药物与CA-4合用,克服两药自身临床应用的限制,以期在提高两者疗效的同时降低化疗药物的毒副作用。方法和结果：通过肿瘤细胞增殖抑制实验结果表明,肿瘤坏死因子超家族成员TRAIL与CA-4合用在人结肠癌SW620和HCT116细胞中具有协同抑制细胞增殖的作用。而DAPI染色和PI单染结合流式细胞术显示这种协同抑制细胞增殖的作用是通过诱导细胞的凋亡来实现的,且两药合用引起的细胞凋亡率比单用组的凋亡率要高6-8倍。进一步根据western blot数据表明这种细胞凋亡的生物学效应可能是通过直接激活caspase酶级联反应而引起的。人结肠癌SW620裸小鼠移植瘤实验也证实TRAIL和CA-4合用后对SW620肿瘤的生长有显著的协同抑制作用,6.25mg/kg CA-4,30mg/kg TRAIL单用组以及合用组在给药20天后的抑瘤率分别为31.2%,59.2%和78.1%。此外肿瘤组织切片的TUNEL染色实验表明给药后确实能引起肿瘤组织中的细胞发生凋亡,并且根据TUNEL染色的荧光强度显示两药合用组引起的细胞凋亡要明显地高于两药单用组。为进一步揭示TRAIL和CA-4合用协同诱导凋亡的潜在机制,我们通过免疫荧光技术以及核质分离试验初步表明转录因子NF--κB的核转位过程受抑制是两药合用产生协同效果的前提。结论：本实验通过相关抗肿瘤活性的评价,发现肿瘤坏死因子超家族成员TRAIL和CA-4联合用药可协同抑制人结肠癌细胞的增殖。并且采用分子生物学技术初步证实这种联合用药方式可能是通过抑制转录因子NF--κB的核转位,影响了NF-κB对下游相关基因的转录调控,诱导肿瘤细胞发生凋亡来实现的。基于TRAIL对肿瘤细胞的高选择性,而对正常组织细胞的毒性较小,TRAIL和CA-4两药的联合应用将为今后的临床合理用药提供新的思路和方案。第三部分Combretastatin A-4诱导的自噬及其抗肿瘤作用的机制研究目的：CA-4具有广谱的抗肿瘤活性,并且在远低于最大耐受剂量的浓度下,CA-4能导致肿瘤血管关闭、坏死进而发挥其抗肿瘤活性。随着临床试验的深入,人们发现CA-4不能完全发挥其药效,究其原因可能是其无法抑制化疗后残存肿瘤组织的增殖,但具体机制并不明确。而本部分实验的研究重点在于探索CA-4的抗肿瘤活性与自噬之间的关系,并希望通过对两者相互作用的分子机制的研究,解决CA-4在临床上运用受限制的原因,有针对性地开发以CA-4为核心的临床用药的配伍方案,以提高CA-4自身抗肿瘤活性,扩大CA-4的临床应用前景。方法和结果：在本课题的研究中我们利用经典的检测自噬的手段,如吖啶橙染色法,GFP-LC3标示法以及LC3I/II比值法,观察到CA-4能诱导多种肿瘤细胞发生自噬。接着在给予了自噬抑制剂3-MA或者采用siRNA沉默技术降低调节细胞自噬过程中的重要因子Atg5的表达后,流式细胞术检测细胞凋亡率的结果表明CA-4诱导的.自噬属于保护性自噬,抑制自噬的发生可以增强CA-4诱导细胞凋亡的能力。进一步地通过western blot实验表明,在非InTOR依赖性的Bcl2-III型P13K复合物-beclin1信号转导通路中,Bcl-2的磷酸化水平明显上调,而在转入JNK-1siRNA抑制Bcl-2的磷酸化水平后发现CA-4引起的细胞自噬被抑制,而CA-4诱导的细胞凋亡能力明显增强。结论：我们首次发现作为血管靶向药物CA-4能诱导多种细胞产生自噬,通过采用经典的细胞与分子生物学实验技术与方法初步阐明CA-4引起细胞自噬的分子机制,即Bcl2-PI3K-beclin1信号转导通路可能在CA-4引起的自噬中发挥着重要作用。而在这过程中自噬的发生极大限制了CA-4诱导细胞产生凋亡的能力,引入自噬抑制剂能显著得增强CA-4诱导细胞发生凋亡的能力。本项目的研究初步揭示了CA-4引起肿瘤细胞自噬的机制,及与其抗肿瘤作用之间的关系,而且可为其它可诱导肿瘤细胞自噬的抗肿瘤药物的临床应用提供重要的理论参考。