肠神经系统(enteric nervous system, ENS)是位于胃肠道壁内的一套独立的神经系统。它们主要控制和协调胃肠道的运动、肠壁内的血流量、肠细胞的分泌和电解质代谢,以适应机体消化功能的需要。根据在肠壁内的位置,肠神经系统主要分为两部分:位于环形肌和纵行肌之间的肠肌丛和位于粘膜下层的粘膜下丛。肠神经系统完成以上神经反射需要依赖多种神经活性分子以及与它们受体之间复杂的相互作用。阿片类物质就是这些神经活性分子中的一员,它们分布于肠神经系统并参与调节胃肠道活动。如长期服用阿片类制剂可造成此调节过程失常,从而导致胃肠道功能紊乱。阿片受体作为阿片肽类物质功能活动的中间信使广泛分布于胃肠道,其中μ阿片受体(MOR)的分布要明显多于其它阿片受体。內吗啡肽1(endomorphine-1,EM1)和內吗啡肽2(endomorphine-2,EM2)是MOR的特异性高亲和性的内源性配体。在体外內吗啡肽通过特异性激活MOR诱导肠神经细胞的内吞。药理学和生理学实验表明,內吗啡肽通过MOR的介导可调节胃小肠的收缩和蠕动。但是由于对內吗啡肽在胃肠道中的分布还未确定，相应对胃肠道活动的调节机制也尚未阐明。本实验对EM2在大鼠结肠内的分布及神经化学特性进行了研究,在此基础上在体外初步探索了EM2对大鼠结肠运动的调节机制。方法和结果:1. EM2阳性神经元在大鼠结肠肠神经系统的分布及其化学神经解剖学特性运用结肠全层铺片和免疫荧光组织化学多重标记的方法探索EM2在大鼠结肠的分布和化学神经解剖学特性。(1)EM2阳性神经元在肠肌丛内的分布及其化学神经解剖学特性在肠肌丛内可见大量EM2阳性神经元。EM2阳性标记物在胞浆内的分布明显多于突起,但胞核无标记。其胞体略呈圆形或椭圆形,平均长35.5±10.8μm,平均宽17.8±4.6μm。从胞体发出数个突起,较长的突起可达100μm以上,其余的突起较短略宽扁。每个神经节大约有10.55±4.2个EM2阳性神经元。EM2阳性神经纤维连接相邻神经节形成致密的网络。所有EM2阳性神经元都呈神经元特异性烯醇化酶(NSE)阳性。EM2阳性神经元占NSE阳性神经元的57±4.1%。此外,在肠肌丛的神经元内,可见EM2与乙酰胆碱转移酶(ChAT)、5-羟色胺(5-HT)、P物质(SP)、钙视网膜蛋白(CR)、血管活性肠肽(VIP)和一氧化氮合酶(NOS)均有共存。ChAT阳性标记物在胞浆分布明显,胞体呈略圆形或椭圆形。在神经节内,EM2阳性神经纤维走行于ChAT阳性神经元之间,部分EM2阳性神经纤维和终末分布于ChAT阳性神经元周围。5-HT的阳性标记物在突起比较明显,在胞体主要分布于外周。部分5-HT阳性神经纤维和终末分布于EM2阳性神经元的周围。SP的阳性标记物主要分布于突起,胞体较少。其阳性神经纤维穿行于神经节内并分布于EM2阳性神经元周围。VIP阳性神经元的胞体较少,有一个长的轴突和数个短的树突。少量VIP阳性神经纤维和终末分布于EM2阳性神经元的周围。CR阳性标记物的分布特点近似于5-HT阳性标记物,但在神经节内有大量CR阳性神经纤维分布,部分CR阳性神经纤维和终末分布于EM2阳性神经元周围。NOS的阳性标记物主要分布于胞浆,胞核无标记。在NOS阳性神经元的周围有EM2阳性神经纤维分布。在肠肌丛,ChAT/EM2、5-HT/EM2、VIP/EM2、NOS/EM2、CR/EM2和SP/EM2的双标神经元数量分别占EM2阳性神经元的53±4.6%、37±4.3%、26±2.8%、49±4.2%、55±4.5%和26±4.5%。ChAT/EM2、5-HT/EM2和SP/EM2双标神经元分别占ChAT、5-HT和SP阳性神经元总数的的74±4.7%、76±3.2%和88±2.5%。所有CR、VIP和NOS阳性神经元均呈EM2阳性。在肠肌丛没发现EM2与CGRP共存的神经元,但CGRP阳性神经纤维走行于EM2阳性神经元之间,部分CGRP阳性神经纤维和终末包绕于EM2阳性神经元的周围。免疫荧光组织化学三标染色的标本上,可见EM2/ChAT/VIP、EM2/ChAT/NOS三者共存于同一个神经元。EM2/ChAT/VIP三标神经元的数量分别占EM2、ChAT和VIP阳性神经元总数的24.4±4.5%、21.8±4.6%和84.6±2.6%。EM2/ChAT/NOS三标神经元的数量分别占EM2、ChAT和NOS阳性神经元总数的27.4±4.1%、23±4.6%和72.5±3.2%。(2)EM2阳性神经元在粘膜下丛内的分布及其化学神经解剖学特性在粘膜下丛也可见大量EM2阳性神经元分布,但分布比较弥散,大约有6±4.2个EM2阳性神经元组成一个神经节。在神经节外还有少许游离的EM2阳性神经元。所有EM2阳性神经元均呈NSE阳性。EM2阳性神经元的数量占NSE阳性神经元总数的68±1.5%。此外,在粘膜下神经元内,EM2与ChAT、SP、VIP和NOS均有共存。在粘膜下丛,ChAT/EM2、SP/EM2、VIP/EM2和NOS/EM2双标神经元的数量分别占EM2阳性神经元的91±2.6%、36±2.4%、44±2.5%和44±4.7。ChAT/EM2、SP/EM2和VIP/EM2双标神经元分别占ChAT、SP和VIP阳性神经元总数的的53±2.8%、75±3.4%和73.3±2.6%。所有NOS阳性神经元均呈EM2阳性。在粘膜下丛神经元内未见EM2与CGRP的共存,但有大量CGRP的阳性神经纤维和终末包绕在EM2阳性神经元的周围。在免疫荧光组织化学三标染色的标本上,可见EM2/ChAT/VIP三者共存于同一个神经元。这些三标神经元的数量分别占EM2、ChAT和VIP阳性神经元总数的45.8±3.0%、57.9±2.6%和73.3±2.7%。以上形态学结果表明,在大鼠结肠内存在EM2阳性神经元,EM2同多种具有特定功能的神经递质共存于肠肌丛和粘膜下丛内的神经元。2.在体外EM2对大鼠结肠运动的作用本研究在体外条件下,采用药理学和机能学的方法,初步探索EM2对大鼠结肠运动的调节机制。(1)EM2对大鼠结肠运动的直接作用直接加入EM2(10–9～10–6 mol/L)对大鼠结肠运动不产生任何作用。卡吧胆碱(10–6 mol/L)和5-HT(10–6 mol/L)可诱导结肠明显收缩;再加入EM2(10–6 mol/L)后,对卡吧胆碱或5-HT诱导的结肠收缩无任何影响。(2)MOR激动剂和拮抗剂对电刺激诱导结肠收缩的作用电刺激结肠产生明显的单收缩波(4.38±0.13 g,对照),再加入EM2(10–9 mol/L～10–6 mol/L)可浓度依赖性抑制电刺激诱导结肠的收缩;在浓度为10–6 mol/L时,EM2产生最大的抑制效果(62±7.1%);再加入纳洛酮(10–5 mol/L)或β-funaltrexamin(β-FNA,10–6 mol/L)后,可阻断EM2对电刺激诱导结肠收缩的抑制效应。吗啡(10–5 mol/L)和[Dala2, NMe-Phe4, Gly-ol5]enkephinlin(DAMGO,10–5 mol/L)也可抑制电刺激诱导结肠的收缩,且抑制率分别达到67.6±6.9%和58.7±6.1%。(3)EM2和不同神经阻断剂对电刺激诱导结肠收缩的作用河豚毒素(TTX,10-4 mol/L)可完全阻断电刺激诱导的结肠收缩。阿托品(AT,10-5 mol/L)能将电刺激诱导结肠收缩的效应减少至53.2±7.1%;再加入EM2(10-6 mol/L),此抑制效应进一步增强(24.3±7.8%);颠倒AT和EM2给药的顺序,可观察到相同的结果。同样,3-tropanylindole-3-carboxylate methiodide(ICS,10-6 mol/L)也可抑制电刺激诱导结肠的收缩(74.9±8.9%);再加入EM2(10-6 mol/L)后此抑制效果也进一步增强(35.4±7.8%)。加入NG-硝基-L-精氨酸,N-硝基-L-精氨酸(NG-Nitro-L-arginine Methyl Ether,L-NAME,10-4 mol/L)后再行电刺激,电刺激诱导的结肠收缩出现增强效应(105.5±8.1%);再加入EM2(10-6 mol/L)后,收缩波的强度略减少(86.7±6.5%)。反过来,当将L-NAME和EM2的给药颠倒顺序时,则EM2抑制的结肠收缩波出现小的反弹。加入血管活性肠肽片段6-28(VIP6-28,10-6 mol/L)后再行电刺激,电刺激诱导的结肠收缩出现微弱增强(101.1±11%);再加入EM2时,收缩波略有下降(82.9±5.8%)。以上机能学研究结果表明,EM2通过MOR的介导,可诱导抑制性神经递质的释放,间接地调节大鼠结肠的运动。综上所述,大鼠结肠内分布着许多EM2阳性神经元,EM2同多种具有特定功能的神经递质共存于肠肌丛和粘膜下丛内的神经元。在体外,EM2通过MOR的介导,直接诱导抑制性肠神经递质的释放,从而间接地调节结肠的运动。