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生肌决定因子1（myogenic differentiation 1,MyoD1）是肌源性调节因子（myogenic regulatory factors,MRFs）家族的重要成员。其作为一种核磷酸蛋白,以转录因子的形式参与动物生长发育过程中多个生理调控途径。其主要功能是在胚胎发育早期促进肌原细胞向成肌细胞分化,以及在个体生长发育过程中参与肌肉生长和损伤肌肉修复的调节。MyoD1是动物生长发育过程中不可或缺重要调控因子,同时也是畜禽良种选育工作中的主要候选基因。本研究以贵州关岭牛和威宁牛为研究对象,首先检测并分析MyoD1基因启动子甲基化状态与其基因表达水平间的关系。其次,构建甲基化和非甲基化的MyoD1基因启动子双荧光素酶报告载体,转染至关岭牛原代成肌细胞后检测分析甲基化对MyoD1基因启动子活性的影响。在关岭牛原代成肌细胞中过表达和干扰MyoD1基因,而后检测分析MyoD1过高或过低表达对其启动子甲基化状态的影响。最后,在关岭牛原代成肌细胞中分别过表达MyoD1和肌肉生长抑制素（myostatin,MSTN）基因,以验证MyoD1与MSTN间的相互调控作用。主要研究结果如下:1 MyoD1启动子甲基化与其转录水平的关联性分析采用亚硫酸氢盐测序法（bisulfite sequencing,BSP）对关岭牛和威宁牛组织中MyoD1基因在启动子区CpG岛上的甲基化状态进行了分析,并与qRT-PCR检测得到的mRNA表达量结果进行了关联性分析,以明确MyoD1基因启动子甲基化状态及其基因表达水平间的关系。结果显示,关岭牛心脏、肝脏、小肠、背最长肌、大腿肌和脂肪组织中MyoD1基因启动子第1 CpG岛甲基化率分别为30.00%、31.43%、36.67%、28.10%、31.43%和33.81%;威宁牛分别为29.05%、30.95%、36.67%、28.57%、32.86%和32.38%。qRT-PCR结果显示关岭牛心脏、肝脏、小肠、背最长肌、大腿肌和脂肪组织中MyoD1基因相对表达水平为7.40±0.381、4.87±0.384、0.36±0.028、37.89±4.644、2.50±0.048和0.81±0.138;威宁牛为8.52±0.836、4.06±0.270、0.29±0.033、24.29±2.056、2.27±0.219和1.00±0.064。MyoD1基因转录表达水平与其启动子区第1 CpG岛甲基化率之间的相关系数为-0.710（P=0.01）,而与第1 CpG岛内CpG-1-6和CpG-1-7两个位点甲基化率之间的相关系数为-0.737（P=0.006）。结果表明,MyoD1基因的转录表达与其启动子甲基化程度呈负相关。2 MyoD1启动子甲基化对其启动活性的影响研究首先通过免疫细胞化学染色法鉴定分离培养的关岭牛原代成肌细胞。提取细胞DNA后,PCR扩增关岭牛MyoD1基因启动子序列,并构建甲基化和和非甲基化的pGL3-MyoD1-pro启动子双荧光素酶报告载体。经BSP测序鉴定,构建的甲基化的报告载体上启动子的甲基化率为95.24%±0.67%。将两种报告载体分别转染至关岭牛原代成肌细胞后,检测分析对照组相对荧光素酶活性变化为0.039±0.007,非甲基化组为2.994±0.237,甲基化组为0.685±0.048。表明MyoD1基因启动子发生高甲基化后,其启动转录的活性下降。3 MyoD1表达水平对其启动子甲基化的影响研究试验通过构建pEGFP-N3-MyoD1过表达载体,合成并筛选获得MyoD1基因shRNA干扰载体p GPH1/RFP/Neo-MyoD1-cattle-263。将过表达载体和干扰载体分别转染至关岭牛原代成肌细胞后,BSP检测过表达组MyoD1启动子第1 CpG岛甲基化率较之对照组分别从42.86%上升至50.95%,CpG-1-6和CpG-1-7单位点甲基化率分别从30.00%、26.67%增至53.33%、50.00%。干扰组MyoD1启动子第1 CpG岛甲基化率较之对照组分别从42.38%下降至33.33%,CpG-1-6和CpG-1-7点甲基化率分别从30.00%、33.33%降至6.67%、13.33%。表明MyoD1基因表达水平过高或过低均会促使其启动子甲基化水平发生改变。4对MyoD1与MSTN相互表达调控的研究构建pEGFP-N3-MSTN过表达载体和pGL3-MSTN-pro启动子报告载体。将pEGFP-N3-MyoD1和pEGFP-N3-MSTN分别转染至关岭牛原代成肌细胞。过表达MyoD1后,处理组细胞中MyoD1相对表达量相比对照组从1.018±0.222上调至8283.987±2337.534（P=0.004）,同时MSTN基因的相对表达量从1.005±0.132上调至7.849±1.089（P=0.0004）;而MSTN过表达组细胞中MSTN相对表达量相比对照组从1.003±0.092上调至121131.802±12474.046（P=0.004）,同时MyoD1基因的相对表达量从1.003±0.099下调至0.103±0.016（P=0.0001）。在进一步的试验中,过表达MyoD1后,处理组细胞中相对荧光素酶活性变化相比对照组从1.131±0.051上调至3.030±0.212（P=0.0001）;而过表达MSTN组细胞中相对荧光素酶活性变化相比对照组从1.797±0.136下调至0.543±0.092（P=0.0002）。表明MyoD1可正向调控MSTN转录,而MSTN过表达可负调控MyoD1转录。