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高分子量青霉素结合蛋白(Penicillin binding proteins,PBPs)是主要的肽聚糖合成酶,也是β-内酰胺类抗生素的作用靶点。Escherichia coli中,PBP1a和PBP1b分别与外膜脂蛋白LpoA和LpoB形成肽聚糖合成酶复合体,共同参与肽聚糖的合成。两个复合体之间功能冗余,同时缺失导致细胞死亡。Shewanella oneidensis是一种革兰氏阴性菌,前期研究发现该菌也含有两个肽聚糖合成酶复合体(PBP1a/LpoA和PBP1b/LpoB),但二者之间具有不同的生理功能。其中,PBP1a/LpoA复合体缺失后细菌生长变缓,并且对β-内酰胺类抗性增强;而PBP1b/LpoB复合体缺失后无此影响。基于此,本研究系统性比较了两个复合体缺失后的表型差异,并对其内在机制进行深入研究,其结果如下:PBP1a/LpoA缺失的菌株表现出诸多生理缺陷,如细胞形态由杆状变成球形、在不含NaCl的低渗培养基(NaCl-less)中无法生长、对十二烷基磺酸钠(SDS)敏感性增强等;而PBP1b/LpoB缺失的菌株无此表型缺陷。进一步研究发现,PBP1a/LpoA缺失的菌株对万古霉素和N-苯基-1-萘胺(NPN)的摄取能力增强,表明PBP1a/LpoA缺失后,细胞外膜通透性增强,细胞壁完整性受损。基于上述生理表型差异,本研究通过在PBP1a和LpoA同时缺失的菌株(ΔmrcAΔlpoA)中诱导表达PBP1b后发现,当诱导剂浓度较低时突变株的表型可以回复,而诱导剂浓度较高时突变株的表型无法回复。另外,PBP1b由3个结构域组成,任何结构域的缺失均不能使突变株表型回复。因此,PBP1b的上调表达可在功能上完全补偿PBP1a/LpoA。随后,本研究以ΔmrcAΔlpoA菌株为亲本,利用转座子随机插入突变技术筛选表型回复的突变株(即抑制子)。总计获得13株抑制子,通过随机引物PCR(AP-PCR)以及生物信息学分析发现,转座子集中插入于hrpB、sspA和vanZ基因中。其中,hrpB编码ATP依赖型解旋酶,位于mrcB(编码PBP1b)上游;sspA编码严谨饥饿蛋白;vanZ编码VanZ家族蛋白。与hrpB抑制子表型不同的是,hrpB基因的无痕敲除并不能使ΔmrcAΔlpoA菌株表型回复,表明hrpB抑制子表型回复并非hrpB失活导致。鉴于本研究所用转座子中含有隐藏启动子,推测hrpB抑制子中mrcB基因表达增强,从而在功能上补偿PBP1a。qRT-PCR分析显示hrpB抑制子中mrcB的表达量与亲本相比明显增强。因此,hrpB抑制子表型回复是由PBP1b表达增强所致。与sspA抑制子表型一致的是,sspA基因的无痕敲除使ΔmrcAΔlpoA表型回复,并且能被S.oneidensis和E.coli的sspA遗传回补。qRT-PCR分析显示sspA缺失的突变株中PBP1b表达量显著上调,表明sspA在转录水平上负调控PBP1b的表达,从而影响对PBP1a/LpoA的功能补偿。进一步研究发现SspA并非直接调控PBP1b,可能通过类核蛋白H-NS调控PBP1b表达。