豆类凝集素的提取分离及纯化

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凝集素是一种能够特异性结合碳水化合物的蛋白或者糖蛋白。凝集素广泛地存在于自然界的多种生物中,尤其在豆子的种籽中含量非常丰富。通常采用血凝试验来验证凝集素的存在。凝集素在生物固氮、先天免疫、细胞毒性等方面发挥作用,且实验证明凝集素具有促有丝分裂、抗增殖、抑制HIV-1逆转录酶等多种活性。凝集素在豆类中的含量受到豆类的种属、产地等多种因素的影响,但是目前对于多种豆类中凝集素的活性及分布等的研究报道较少。为便于对凝集素进一步的开发利用,本研究选取23种不同种属、不同地区的食用豆类,对凝集素的总活力及特异性活力进行测定及考察;以小黑芸豆为例,探讨了粗提取因素对凝集素提取的影响,确定了硫酸铵分级沉淀的饱和度范围,并通过DEAE-52及S-200纯化得到凝集素纯品;通过提取、分离及纯化得到了4种芸豆凝集素的纯品,并测定出凝集素亚基的分子量。本文首先对23种不同食用豆类的水溶性蛋白含量、总活力及特异性活力进行测定,探讨了种属、地域对于豆类凝集素的总活力及特异性活力的影响。并以小黑芸豆为例,考察了种籽不同部位的凝集素分布情况。实验结果表明菜豆属的豆类总活力及特异性活力整体较高,最高的为红芸豆,有两种芸豆未表现出凝集活性;豇豆属及大豆属的凝集素总活力及特异性活力显著低于菜豆属;子叶中凝集素总活力及特异性活力均最高,种皮中无凝集素检出。此外,以小黑芸豆为例研究了粗提取条件,确定硫酸分级沉淀范围及DEAE-52、S-200的实验条件;纯化4种芸豆凝集素并测定了分子量。研究结果表明选pH7.2的磷酸盐缓冲溶液、料液比1:10、提取时间18h作为提取条件,此时测得的蛋白含量为7.61g/100g、总活力为11.3×107HU、特异性活力为17.53×103HU。硫酸铵分级沉淀范围选为20%~80%时的纯化倍数为1.11倍,经DEAE-52及S-200后的纯化倍数为9.42倍。相同方法测得红芸豆、花芸豆及大白芸豆中的凝集素含量分别为437mg/100g、296mg/100g、178mg/100g,比活力分别为311.67×103HU/mg、156.42×103HU/mg、78.67×103HU/mg,分子量分别为32.26kDa、32.43kDa、32.59kDa。凝集素具有很好的商业应用前景,但目前对于我国豆类凝集素的研究较少。本研究作为豆类凝集素的基础研究,仅仅了解了豆类凝集素的分布及活性,对于凝集素的特性、生物活性、应用开发等还需要进一步的研究。
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