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异丁醇因其具有高能量密度、高辛烷值、低吸湿性、低混合蒸汽压等优良特性而成为可替代汽油的新一代生物燃料。本研究旨在通过改造大肠杆菌的缬氨酸代谢途径,获得产异丁醇能力佳的工程菌。首先以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主,构建异丁醇的合成代谢途径。将2-酮酸脱羧酶基因(kivd)和乙酰乳酸合成酶基因(alsS)分别克隆至质粒载体pCDFDuet的两个启动子下,醇脱氢酶基因(yqhD)和经重叠PCR连接后的乙酰乳酸异构酶基因(ilvC)及二羟基酸脱水酶基因(ilvD)分别克隆至载体pRSFDuet或pACYCDuet的两个启动子下,通过双质粒共转化,构建成两种多启动子共表达系统,分别获得工程菌Eco(CDF+RSF)和Eco(CDF+ACYC)。结果表明,工程菌Eco(CDF+ACYC)具有更佳的产异丁醇能力,产量达3.5g/L,得率为0.11g/g葡萄糖,因此确定工程菌Eco(CDF+ACYC)为本研究的出发菌。其次,考察了工程菌Eco(CDF+ACYC)产异丁醇代谢途径中的限速酶。将克隆有单个代谢酶基因的第三种相容质粒pET30-alsS, pET22-ilvC, pET22-ilvD, pETDuet-kivd, pET30-yqhD分别引入工程菌Eco(CDF+ACYC)中,获得五种三质粒共转化工程菌,即Eco(alsS+)、Eco(ilvC+)、Eco(ilvD+)、Eco(kivd+)及Eco(yqhD+)。各工程菌中,增加基因拷贝的酶活力及表达量均获得提高,其他酶则相对下降,五种工程菌中仅Eco(kivd+)的产异丁醇能力有所提高,发酵24h产异丁醇4.0g/L,得率0.12g/g葡萄糖。结果表明,基因kivd编码的KDCA为限速酶。最后,基于限速酶,调整了共表达策略。将限速酶基因kivd克隆至载体pET30a(+)或pRSFDuet上,与表达载体pACYCDuet-yqhD-ilvCD及pCDFDuet-alsS共转化至大肠杆菌中,分别获得两种优化菌Eco01及Eco02,该两种菌都提高了限速酶的表达,KDCAEco01的活力提高了5.6倍,KDCAEco02的活力提高至KDCAEco(CDF+ACYC)的1.5倍；且产异丁醇能力均高于出发菌,Eco01产异丁醇最高达4.5g/L,得率0.13g/g葡萄糖,Eco02产异丁醇能力最佳,间歇发酵24h达5.4g/L,比工程菌Eco(CDF+ACYC)高54%,得率为0.15g/g葡萄糖,为后续的工业化应用研究奠定了良好的基础。