研究背景胃癌(Gastric carcinoma,GC)是世界范围内发生率排名第四的恶性肿瘤,其死亡率占所有癌症死亡的第二位。曲妥珠单抗(Trastuzumab,商品名Herceptin)是一种靶向作用于人表皮生长因子受体2(Hunman epidermal growth factor receptor2,HER2)的人源化单克隆抗体,主要通过拮抗HER2信号转导通路的传递而发挥抑制肿瘤细胞生长的作用。与单纯化疗相比,曲妥珠单抗联合化疗显著延长了 HER2阳性晚期胃癌患者的生存期。但是,曲妥珠单抗耐药严重影响了胃癌患者的临床疗效。目前,曲妥珠单抗耐药现象已成为胃癌临床治疗亟需解决的重要问题之一。近年来的研究证实,内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)与肿瘤耐药关系密切。在细胞缺氧、糖供应不足、钙离子稳态失衡等情况下,肿瘤细胞均可引发ERS,并通过激活未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR),增强自身对损伤的抗性及其存活能力。作为一种内源性的细胞适应性保护机制,ERS可参与调控肿瘤细胞耐药,但其在胃癌曲妥珠单抗耐药中的作用及其机制尚不清楚。mircroRNA是一种内源性基因调节因子,对肿瘤细胞的发生、发展及耐药具有重要的调节作用,并且广泛参与ERS的信号调节通路。在肿瘤微环境中,外泌体作为miRNAs的重要载体,可防止其降解。此外,外泌体作为细胞间信号交流的一种形式,与肿瘤的发生发展及耐药性的传递密切相关。本课题拟重点探讨ERS在胃癌曲妥珠单抗耐药发生与传递中的作用及其机制。内容和方法1.HER2阳性胃癌细胞内质网应激模型建立:以ERS激活剂Thapsigargin(TG)或无糖培养基(-Glu/FBS)分别处理HER2阳性胃癌细胞株,处理后不同时间点以Western blot检测GRP78的蛋白表达。2.CCK8法检测不同状态胃癌细胞对曲妥珠单抗的敏感性差异。3.microRNA芯片筛选平台技术对正常状态胃癌细胞及其在ERS状态下的miRNA表达谱进行差异筛选。4.采用阳离子脂质体法进行细胞瞬时转染miRNA抑制剂或阴性对照,转染48h后加用TG处理,CCK8法检测细胞对曲妥珠单抗的敏感性变化。5.采用超速离心法进行外泌体的分离纯化;透射电子显微镜观察外泌体形态;颗粒粒度分析仪检测外泌体数量和大小分布;Western blot检测外泌体表面标志性蛋白CD63和CD81的蛋白表达。6.以不同状态胃癌细胞来源的外泌体孵育受体胃癌细胞,CCK8法检测受体细胞对曲妥珠单抗敏感性的变化。7.实时荧光定量 PCR 法(Real-Time Quantitative Reverse Transcription PCR QRT-PCR)检测细胞或外泌体中miRNA的表达水平。8.Western Blot 法检测细胞 GPR78、ERK、p-ERK、AKT 和 p-AKT 蛋白的表达水平。9.统计学方法:实验数据用均数±标准差表示,多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVAtest),两组间比较采用t’检验(two-tailed Student’s t-test)。P<0.05为差异有统计学意义。结果1.ERS状态下HER2阳性胃癌细胞对曲妥珠单抗的敏感性显著降低。2.ERS状态下HER2阳性胃癌细胞的miRNA表达发生显著变化;筛选其中表达显著升高的11条miRNA,以相应的miRNA inhibitor下调其表达;结果发现,通过下调miR-301a-3p的表达,ERS诱导产生的曲妥珠单抗耐药性明显减弱,p-ERK和p-AKT蛋白表达在曲妥珠单抗的作用下明显下调;而GRP78的表达并不受miR-301a-3p表达水平的影响。3.经ERS状态HER2阳性胃癌细胞的培养液上清或ERS状态HER2阳性胃癌细胞释放的外泌体孵育后,受体细胞对曲妥珠单抗的敏感性显著降低,GRP78的表达未升高,p-ERK和p-AKT蛋白表达在曲妥珠单抗的作用下未出现下调。4.ERS状态下HER2阳性胃癌细胞释放的外泌体,其miR-301a-3p表达水平显著升高;经ERS状态细胞释放的外泌体处理后,受体胃癌细胞的miR-301a-3p表达水平显著升高;经转染miR-301a-3p inhibitor的ERS状态胃癌细胞来源的外泌体孵育后,受体细胞对曲妥珠单抗不产生耐药性。结论1.ERS诱导HER2阳性胃癌细胞对曲妥珠单抗产生耐药。2.ERS通过miR-301a-3p的过表达参与调控HER2阳性胃癌细胞对曲妥单抗的耐药。3.ERS状态HER2阳性胃癌细胞通过释放外泌体将耐药性传递至受体胃癌细胞。4.ERS状态HER2阳性胃癌细胞释放的外泌体通过转运miR-301a-3p的方式传递耐药性。