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研究目的在临床上,由于种植体周围炎,拔牙创伤,肿瘤术后等造成的大面积骨缺损修复一直是治疗的难题。许多研究表明微小RNA(miRNAs)参与调控成骨分化的过程。因此,本研究从miR-30d入手,探讨其在骨再生中的调控机制,为骨缺损的修复提供新的治疗思路。材料与方法1.分离培养大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs);实时荧光定量PCR(RT-PCR)明确miR-30d inhibitor转染BMSCs的浓度及效率;运用碱性磷酸酶染色及活性检测、茜素红染色及半定量实验、RT-PCR、蛋白免疫印迹(western blot)、cell counting kit-8(cck-8)等方法检测miR-30d inhibitor对BMSCs成骨分化能力及增殖的影响。2.利用数据库预测miR-30d的下游靶基因;RT-PCR、western blot检测其表达水平;双荧光素酶进一步证实预测结果;将构建的靶基因载体si-SOCS1转染至含miR-30d inhibitor的BMSCs中,通过RT-PCR、western blot检测BMSCs向成骨方向分化的情况。3.分别在4h和24h两个时间点,电镜观察转染antagomir-30d的BMSCs在CPC上的细胞形态;RT-PCR检测转染antagomir-30d的BMSCs在CPC支架上成骨分化的能力。研究结果1.成功分离得到大鼠BMSCs;当miR-30d inhibitor转染浓度为200nM时效果适宜;转染miR-30d inhibitor后,碱性磷酸酶染色及活性检测,茜素红染色及半定量实验和相关成骨基因在mRNA和蛋白水平都高表达,但是对细胞增殖没有明显影响。2.数据库预测结果为miR-30d的下游靶基因可能为SOCS1;RT-PCR、western blot结果表明:miR-30d在转录水平和蛋白水平上负调控靶基因SOCS1的表达;双荧光素酶报告结果表明SOCS1是miR-30d的直接靶基因;抑制SOCS1后减弱了miR-30d inhibitor促进成骨的作用,miR-30d抑制成骨的作用是通过靶向SOCS1来实现的。3.转染antagomir-30d后,4h时电镜观察到BMSCs已经粘附在CPC支架上,但是并没有完全铺展开,24h时发现细胞完全铺展开,并伸出很多分支;在CPC支架上,RT-PCR结果表明抑制miR-30d的表达后成骨相关基因的表达显著升高。研究结论抑制miR-30d可以有效地促进BMSCs向成骨方向分化;进一步阐明了miR-30d通过靶向作用于SOCS1发挥抑制成骨的作用,这可能是与SOCS1参与某个成骨通路或者免疫调节有关;CPC支架可以作为良好的细胞载体用于组织工程复合物的支架材料。以上结果为miR-30d应用于骨缺损的治疗和促进骨再生提供了实验基础。