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目的:急性肾损伤(Acute kidney injury,AKI)是指各种原因引起的短时间内肾功能快速减退而出现的一系列临床综合征,可逐渐进展为慢性肾脏病(Chronic kidney disease,CKD)。叶酸(Folic acid,FA)诱导肾损伤模型的病变特点是氧化应激引起肾小管损伤及进行性间质纤维化。大量活性氧的产生及抗氧化能力的下降是氧化应激介导肾小管上皮细胞损伤的公认机制。铁死亡是铁依赖的脂质过氧化反应而出现的细胞死亡,是AKI的主要原因之一。AKI与CKD密切相关,是CKD发生的独立危险因素。因此,有效预防用药改善AKI的预后有着重要意义。罗沙司他(FG-4592)是低氧诱导因子(Hypoxia inducible factor,HIF)脯氨酰羟化酶的抑制剂,是一种HIF稳定剂。近年来的研究发现HIF-1α具有抗氧化活性,在缺血性心脏病和脊髓损伤中有一定的保护作用。本研究应用FA诱导肾损伤模型,探讨FG-4592预防用药(pretreatment)对肾损伤的影响,并探讨其可能的作用机制。研究方法:1.建立FA肾损伤模型,实验组行FG-4592预防用药:本研究以6至8周雄性C57BL/6小鼠为研究对象,使用FA腹腔注射构建急性肾小管损伤及肾脏纤维化模型,在FA注射前2天一次性给予FG-4592腹腔注射,观察FG-4592预防用药对肾损伤的保护作用。2.检验模型并评估肾功能:苏木素和伊红(Hematoxylin-eosin staing,HE)染色评估肾脏损伤的组织病理,初步证明FA诱导小鼠急性肾小管损伤模型的成立。采用血清肌酐(Serum creatinine,Scr)和尿素氮(Blood urea nitrogen,BUN)试剂盒检测各组小鼠的肾脏功能。通过Western blot检测肾损伤分子1(Kidney injury molecule 1,KIM-1)的水平评估肾小管损伤。3.检测炎症相关指标:利用组织切片免疫组织化学染色和Western blot定量方法,检测各实验组肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factorα,TNF-α),白细胞介素1β(Interlukin 1β,IL-1β)和巨噬细胞生物学标记物F4/80的表达。4.检测铁死亡相关指标:利用组织切片免疫组织化学染色,Western blot和相关试剂盒定量,检测各组小鼠肾脏脂质过氧化代谢产物4-羟基壬烯醛(4-hydroxynonenal,4-HNE)和丙二醛(Malondialdehyde,MDA)的表达。利用普鲁士蓝铁染色和铁试剂盒检测各组小鼠肾脏组织铁的含量。采用TUNEL染色检测FA诱导小鼠肾小管上皮细胞的铁死亡情况。5.检测抗铁死亡相关指标:采用Western blot和免疫荧光检测核因子类胡萝卜素相关因子2(Nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)的蛋白表达及核转录水平。利用Realtime PCR,Western blot和免疫组织化学染色检测Nrf2/ARE通路中相关基因和蛋白的表达。采用Western blot检测小鼠肾脏组织GSH逆向转运体蛋白(SLC7A11)和膜铁转运蛋白(Ferroportin,Fpn)的表达。利用谷胱甘肽(Glutathione,GSH)试剂盒检测各组小鼠肾脏组织GSH的水平。6.检测抗铁死亡机制的指标:利用Western blot检测HIF-1α蛋白,Keap1蛋白和PI3K/Akt信号通路相关蛋白的表达。使用PI3K/Akt信号通路抑制剂Wortmannin后检测各组小鼠肾脏组织PI3K/Akt信号通路相关蛋白的变化。7.检测纤维化相关指标:马松染色(Masson)评估肾脏间质的纤维化,初步证明FA诱导小鼠肾脏纤维化的成立。免疫组织化学染色和Western blot检测纤连蛋白(Fibronectin,Fn),IV型胶原蛋白(Collagen IV,Col IV)和波形蛋白(Vimentin)的表达,进一步评估肾脏纤维化程度。结果:1.FG-4592预防用药减轻FA诱导的小鼠急性肾小管损伤小鼠FA注射2天后取材,HE染色显示FA组小鼠肾小管损伤严重,表现为肾小管上皮细胞肿胀和空泡变性,管腔狭窄、管腔内可见脱落细胞和透明管型,皮质血管周围大量炎性细胞浸润,提示急性肾小管损伤。此外,FA组小鼠Scr和BUN水平明显升高,伴有肾脏组织KIM-1(肾小管损伤的标志物)蛋白的表达上调,而FA+FG-4592组的肾小管损伤明显减轻,同时Scr和BUN水平下降。对照组和FG-4592组肾脏功能和肾脏组织形态正常。2.FG-4592预防用药减少FA诱导的小鼠肾脏炎症FA注射2天后,免疫组织化学染色显示FA组肾小管上皮细胞TNF-α和IL-1β表达明显增多,Western blot结果也显示FA组的TNF-α和IL-1β蛋白表达较对照组增多。此外,免疫组织化学染色显示FA组肾小管间质巨噬细胞浸润增多,而FA+FG-4592组TNF-α和IL-1β的蛋白表达及巨噬细胞的浸润均较FA组明显减少。3.FG-4592预防用药减少FA诱导的小鼠肾小管上皮细胞铁死亡免疫组织化学结果显示,与对照组相比,FA组肾小管上皮细胞膜的脂质过氧化产物4-HNE表达增加,与FA组相比,FA+FG-4592组4-HNE的表达明显减少。Western blot结果显示4-HNE蛋白表达水平与免疫组织化学染色一致。此外,连续切片免疫组织化学染色和普鲁士蓝铁染色显示,FA+FG-4592组肾小管上皮细胞膜MDA蛋白表达及细胞内铁的含量均较FA组明显减少,表明FG-4592预防用药减少肾小管上皮细胞的铁死亡。4.应用Ferrostatin-1(Fer-1)处理进一步证明FA诱导的小鼠肾小管上皮细胞铁死亡存在HE染色结果显示,与FA组相比,FA+Fer-1组小鼠的肾小管损伤明显减轻,SCr和BUN水平下降,免疫组织化学染色MDA和4-HNE水平明显降低。进一步应用TUNEL染色显示,FA组TUNEL阳性细胞数明显增加,而FA+Fer-1组TUNEL阳性的细胞数较FA组明显减少,进一步证明FA诱导小鼠肾小管上皮细胞铁死亡存在,且能被Fer-1有效抑制。5.FG-4592预防用药逆转FA诱导的小鼠肾脏HIF-1α蛋白的降低Western blot结果显示,FA组小鼠肾脏HIF-1α蛋白的表达较对照组明显减少,而FG-4592组和FA+FG-4592组HIF-1α的表达均高于FA组,其中FG-4592组的表达量最多。6.FG-4592预防用药增加FA诱导的小鼠肾脏Nrf2/ARE通路的激活Western blot显示,FA组小鼠肾脏细胞核和细胞质Nrf2蛋白的表达较对照组显著减少,与FA组相比,FA+FG-4592组Nrf2表达量增加,但在所有组中FG-4592组Nrf2表达量最高。免疫荧光染色显示,与对照组相比,FG-4592组肾小管上皮细胞表现广泛的Nrf2核转录,而FA+FG-4592组逆转了FA组Nrf2核转录的减少。Realtime PCR,Western blot和免疫组织化学染色结果显示,与对照组相比,FA组Nrf2下游的GPX4和HO-1的mRNA及蛋白表达水平明显下降,FA+FG-4592组则逆转降低的GPX4和HO-1的mRNA及蛋白水平。7.FG-4592预防用药增加FA诱导的小鼠肾脏GSH含量及SLC7A11和Ferroportin蛋白的表达GSH试剂盒的结果显示,FG-4592组较对照组的GSH含量增加,一致的,FA+FG-4592组较FA组GSH的含量明显增加。Western blot结果显示,FA+FG-4592组较FA组Nrf2的下游靶蛋白SLC7A11和Ferroportin明显上调,与GSH水平升高和铁含量下降一致。8.FG-4592预防用药通过Akt/GSK-3β/Nrf2途径降低铁死亡Western blot结果显示,与对照组相比,FA组p-Akt/Akt和p-GSK-3β/GSK-3β的含量明显下降,而与FA组相比,FG-4592组和FA+FG-4592组的p-Akt/Akt和p-GSK-3β/GSK-3β明显增加。应用PI3K抑制剂Wortmannin抑制PI3K/Akt信号通路,Western blot结果显示,与FA组相比,FA+Wortmannin组p-Akt/Akt,p-GSK-3β/GSK-3β,Nrf2,GPX4和HO-1的蛋白表达均减少。一致地,与FA+FG-4592组相比,FA+FG-4592+Wortmannin组p-Akt/GSK-3β,p-GSK-3β/GSK-3β,Nrf2,GPX4和HO-1的蛋白表达减少,即Wortmannin减弱了FG-4592预防用药对Nrf2的激活。9.FG-4592预防用药延缓FA注射14天后小鼠的肾间质纤维化Masson染色显示,FA组的肾小管间质胶原纤维明显增多,免疫组织化学染色显示FA组的肾间质fibronectin和collagen IV的沉积明显增多,Western blot结果同样显示FA组小鼠肾脏fibronectin,collagen IV和vimentin的表达较对照组明显增加,这些结果表明我们成功建立小鼠FA注射14天后的肾脏纤维化模型。与FA组相比,FA+FG-4592组的胶原纤维沉积,fibronectin,collagen IV和vimentin的表达均明显减少。结论:1.FG-4592预防用药减轻FA诱导小鼠的急性肾小管损伤及炎症,延缓肾脏纤维化。2.FG-4592预防用药通过Akt/GSK3β/Nrf2途径减少肾小管上皮细胞铁死亡,起到肾脏保护的作用。