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背景近年来,肿瘤免疫细胞治疗因其显著的疗效而在肿瘤治疗中备受瞩目,特别是基于嵌合抗原受体改造的T细胞(CAR-T),在血液系统恶性肿瘤的临床治疗展现出良好的靶向性、杀伤力和持久性,使之成为肿瘤免疫治疗领域最令人信服的突破。然而,尽管CAR-T技术研发不断取得进步,但依然面临着诸多挑战,主要障碍之一为CAR-T虽然具备强大的杀死癌细胞的能力,但其本身所引起的过强免疫应答反应潜在威胁患者生命,并且无论CAR-T或是TCR-T(T细胞受体嵌合型T细胞)等免疫细胞技术,迄今为止对实体瘤的治疗鲜有奏效。NK细胞是除T、B淋巴细胞外,又一重要的免疫细胞,在实体瘤发生发展的早期免疫反应和免疫监视过程中发挥重要作用。相比T细胞,NK细胞具有许多自身的免疫特性和优势。目的本研究通过设计构建嵌合共刺激转换受体(Chimeric Costimulatory Converting Receptor,CCCR)对NK-92细胞进行改造,研究其对实体瘤的特异性识别及抗肿瘤效应。方法通过PCR及常规分子克隆技术合成CCCR编码基因PD1-NKG2D-41BB,使用慢病毒载体,得到重组载体PD1-NKG2D-41BB-pCDH,然后进行慢病毒包装,将得到的病毒侵染NK-92细胞,获得稳定表达所述嵌合共刺激转换受体的抗肿瘤NK-92细胞(即CCCR-NK92细胞)。采用流式细胞术检测CCCR-NK92细胞上PD-1、CD56、CD16的表达;CCK8法比较CCCR-NK92与NK-92细胞的增殖速率;乳酸脱氢酶(LDH)法比较CCCR-NK92与NK-92细胞对肿瘤细胞H1299、EMT6的杀伤效果;Hoechst33342染液检测细胞凋亡;建立人肺癌NOG小鼠皮下移植瘤模型,观察CCCR-NK92细胞在体内的抑瘤效果。结果1.成功构建获得稳定表达嵌合共刺激转换受体PD1-NKG2D-41BB的抗肿瘤NK-92细胞(即CCCR-NK92细胞);2.流式细胞术验证CCCR-NK92细胞中PD-1的表达率为57.4%,而亲本NK92细胞中PD-1几乎不表达;3.流式细胞术结果表明,亲本NK-92细胞与CCCR-NK92细胞中,NK-92的特征性表型CD16均不表达,其另一表型CD56在NK-92细胞以及CCCR-NK92细胞中均有表达;4.CCCR-NK92细胞的增殖水平与亲本NK-92相比并无差异性变化,证明对NK-92的改造并未影响其增殖速率(P>0.05);5.在LDH细胞毒性检测中,不同的效靶比例下,CCCR-NK92的细胞毒性均高于亲本NK92(P<0.001),而在效靶比为5:1的比例下,CCCR-NK92的细胞毒性更是亲本NK92的3~4倍;6.在凋亡实验中,CCCR-NK92细胞在杀伤肿瘤细胞后,出现凋亡的细胞数是NK-92细胞的2倍之多(P<0.001);7.在人肺癌NOG小鼠皮下移植瘤模型中,将CCCR-NK92细胞作为药物对小鼠进行治疗,同时设置PBS对照组与NK-92对照组,每两天对小鼠肿瘤大小进行测量,并绘制曲线,通过数据分析,接受CCCR-NK92细胞治疗的小鼠的肿瘤体积明显小于PBS组与NK-92细胞治疗组(P<0.05)。结论成功构建含有嵌合共刺激转换受体PD1-NKG2D-41BB的NK-92细胞(即CCCR-NK92细胞),并通过体内、外实验证明,CCCR-NK92细胞的抗肿瘤效应明显高于亲本NK-92细胞。