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针对无机微量元素利用率低的难题,本研究自行制备了壳聚糖铜(CS-Cu)并进行了表征,继而运用Caco-2细胞模型探讨其吸收和转运过程,而后以断奶仔猪为试验对象,研究了其对生产性能、粪铜排泄及组织微量元素含量的影响,旨在探讨CS-Cu的吸收机理及其在仔猪上的应用效果,为其作为新型有机铜源添加剂在养殖生产中的应用提供科学依据。
主要研究结果如下:
1.壳聚糖铜的制备:正交试验结果表明,壳聚糖铜的最佳螯合条件为:壳聚糖与Cu2+的质量比为4:1,反应体系的pH值为4.5,Cu2+起始浓度为6mg/ml,反应时间为10h。AFM、XRD和FTIR表征结果显示CS与Cu2+发生了配位反应。
2.Caco-2细胞模型的建立:Caco-2细胞在培养21d后,形成了紧密连接的单层,跨上皮细胞电阻达到了一个相对恒定的值,为567.94±31.85Ω·cm2;标志性漏出物荧光素钠在210min内总透过率为2.39%;刷状缘标志性酶结果显示,肠腔侧碱性磷酸酶活性显著高于基底侧酶活性,表明本试验构建的Caco-2细胞模型符合公认的小肠上皮吸收模型标准。
3.CS-Cu在Caco-2细胞中的吸收转运:CS-Cu和CuSO4在AP→BL和BL→AP的跨膜转运和摄取过程中,转运量和摄取量呈浓度和时间(除浓度外,其他条件下只研究了AP→BL的转运和摄取)依赖性增加,其中CuSO4组的转运量和摄取量显著高于CS-Cu组(P<0.05),但在浓度增至15μmol/L时,CS-Cu在细胞中的摄取量呈饱和趋势;在4℃孵育条件下,CS-Cu和CuSO4在AP→BL的转运量和摄取量与37℃时相比显著降低(P<0.05),与CuSO4组相比,CS-Cu组的转运量和摄取量有升高趋势。Caco-2细胞对CS与CuSO4混合物的转运和摄取显著低于CS-Cu和CuSO4(P<0.05)。结果提示CS-Cu在Caco-2细胞中的吸收可能是通过主动吸收和跨细胞途径的被动吸收同时进行的过程,而CuSO4可能只以单一方式进行吸收,即在低浓度时进行主动吸收,高浓度则以被动吸收为主,同时细胞对CS-Cu的转运量和摄取量显著高于CS与CuSO4混合物。
4.CS-Cu在断奶仔猪中的应用:在饲料中添加50 mg·kg-1CS-Cu(CS-Cu-50)、100mg·kg-1 CS-Cu(CS-Cu-100)和200 mg·kg-1硫酸铜,都不同程度地促进了仔猪生长。与对照组(不添加外源铜)相比,CS-Cu-50组、CS-Cu-100组和200 mg·kg-1硫酸铜组的日增重分别提高了14.6%(P<0.05)、26.3(P<0.05)、28.5%(P<0.05),料重比分别降低了14.0%(P<0.05)、21.8%(P<0.05)和22.3%(P<0.05),其中CS-Cu-100组的日增重和料重比与200 mg·kg-1硫酸铜组相比无明显差异(P>0.05);与200 mg·kg-1硫酸铜组相比,CS-Cu-50、CS-Cu-100组腹泻率有降低趋势(P>0.05)。组织中铜含量测定结果表明:与200 mg·kg-1硫酸铜组相比,CS-Cu-50组和CS-Cu-100组肝脏中铜残留量分别降低了85.3%(P<0.05)和80.6%(P<0.05),肾铜残留量分别降低了29.5%(P<0.05)和13.9%(P<0.05),胆汁铜降低了38.7%(P<0.05)和42.8%(P<0.05)。粪铜含量测定结果显示:CS-Cu-50组和CS-Cu-100组粪铜排泄量较200 mg·kg-1硫酸铜组大幅降低,分别减少75.8%(P<0.05)、69.4%(P<0.05)。本试验结果表明,在与硫酸铜组生产性能相似的条件下,日粮中添加100 mg·kg-1CS-Cu明显促进了断奶仔猪的生长,而且CS-Cu-100组显著降低了肝脏、肾脏和胆汁中铜含量以及粪铜的排泄量。
上述结果提示:(1)本试验成功制备了壳聚糖铜,AFM、XRD和FTIR表征结果显示CS与Cu2+发生了配位反应;(2)培养的Caco-2细胞单层形态、跨膜电阻、碱性磷酸酶活性、荧光素钠透过率均符合要求,可以作为模拟小肠吸收的体外模型;(3)CS-Cu在Caco-2细胞中的吸收可能是主动吸收和跨细胞途径的被动吸收同时进行的过程,而且细胞对CS-Cu的转运量和摄取量显著高于CS与CuSO4混合物;(4)100 mg·kg-1CS-Cu可明显促进断奶仔猪生长,提高饲料利用率,与200mg·kg-1硫酸铜相比具有同等促生长效果且有降低腹泻率趋势;在不改变生长性能的前提下,与高剂量CuSO4(200mg/kg)相比,100 mg/kg壳聚糖铜可使断奶仔猪肾脏铜残留量显著降低,肝脏铜残留量减少80%以上,猪粪中铜排泄量减少70%以上。