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二代测序技术作为测序技术发展史上的一个里程碑,该技术可实现对百万级的DNA分子完成高效深度测序,为基因表达调控和功能研究带来了革命性改变。而RNA-seq作为转录组研究的重要方法,加深了我们对细胞亚群和基因功能的认识,推动细胞中差异性表达基因的发现,有利于阐明疾病的发生机制。现已发展多种RNA-Seq技术,如Drop-seq、MARS-seq及CEL-seq等,但是在临床个体化医疗中,常常需要对稀有组织或少量细胞样本进行RNA-seq分析,协助疾病的诊断和治疗。而少量细胞RNA-seq技术仍面临样本RNA含量过少、建库效率较低的难题。在RNA-seq文库构建过程中常借助Tn5转座酶,可在快速片段化cDNA的同时,可将测序接头连接在片段两端完成文库构建,缩短建库流程。但是前期研究发现,利用Tn5转座体在少量细胞RNA-seq建库过程中,容易引入大量ME(Mosaic End)序列,可产生非特异扩增,形成大量的无效测序Reads,降低RNA-seq数据质量,影响后续测序结果的分析。为解决少量细胞RNA-seq中ME序列带来的非特异性扩增问题,我们需要建立一种高效的少量细胞RNA-seq建库策略。目的:1.优化Tn5转座酶蛋白的表达,纯化方式,提高Tn5转座酶蛋白产量及蛋白纯度,并用于后续少量细胞RNA-seq文库的构建。2.建立一种高效的少量细胞RNA-seq建库策略,减少Tn5转座体在少量细胞RNA-seq建库过程中带来的非特异扩增的干扰,提高Tn5转座酶的RNA-seq建库效率。方法:1.从Tn5质粒中特异性扩增出Tn5蛋白编码基因,借助同源重组技术与pET28a-6His-SUMO载体完成重组质粒的构建。重组质粒转化Codon Plus BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导后实现Tn5蛋白表达。超声裂解细菌,加入DNase与RNase去除裂解液中核酸污染,针对Tn5蛋白中的6×His标签,利用NTA实现对目的Tn5蛋白的分离和纯化。最后通过高浓度咪唑溶液实现Tn5目的蛋白的洗脱,并对产物进行SDS-PAGE胶电泳分析。2.合成Tn5ME-A,Tn5ME-B及Tn5ME-Rev序列,分别逐步退火形成双链,与表达的Tn5转座酶蛋白等完成Tn5转座酶的组装,形成Tn5转座体。为去除转座体体系中未结合的过量Tn5 ME序列,避免其在最后PCR过程中的干扰,将组装后的Tn5转座体通过蛋白浓缩管离心纯化,可将Tn5转座体中分子量低于30 KDa的物体去除,包括未结合的Tn5 ME序列,从而实现Tn5转座体的纯化,并对产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。3.利用纯化后的Tn5转座体与CT DNA进行酶切反应,对产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析,检测Tn5转座体活性。同时,利用Tn5 ME中上下游保守序列对不同浓度下Tn5转座体对CT DNA的酶切产物进行RT-PCR分析,并与商品化Tn5试剂盒对比,进一步对活性检测。根据RT-qPCR结果,将Tn5转座体用于少量RAW264.7细胞RNA-seq文库构建。4.采用流式细胞术从培养的RAW264.7细胞分选出100个细胞。提取RNA后,分别进行逆转录和cDNA第二链合成反应,获得少量细胞中双链cDNA,并分别使用未纯化Tn5转座体,纯化Tn5转座体和标准文库构建试剂盒分别对少量细胞完成测序文库构建,送样上机测序,比较文库质量差异。结果:1.Tn5蛋白编码基因和pET28a-6His-SUMO载体同源重组成功,测序正确。重组质粒SUMO-Tn5转化Codon Plus BL21(DE3)感受态细胞后可以成功表达Tn5蛋白,超声裂解细菌后经过Ni-NTA纯化后,多次洗涤去除裂解液中杂蛋白。最后用高浓度咪唑溶液对Ni珠上的Tn5转座酶蛋白进行洗脱,SDS-PAGE结果显示,可获得较高纯度的Tn5转座酶蛋白。2.Tn5转座体蛋白与Tn5ME-A,Tn5ME-B及Tn5ME-Rev序列组装形成较为稳定的Tn5转座体。利用蛋白浓缩管离心纯化后,对纯化前后产物的电泳结果显示,纯化后的Tn5转座体中未结合的Tn5 ME序列显著减少。3.用纯化后的Tn5转座体对CT DNA进行10 min的酶切反应,产物的电泳结果显示,大小在6000 bp的CT DNA经酶切后,形成500-1500 bp的DNA弥散条带,说明CT DNA已被随机打断,形成长度不一的DNA片段。不同浓度下的Tn5转座体对CT DNA的酶切产物进行RT-PCR分析,发现Tn5转座体中测序接头成功插入至DNA片段中,且1/40倍Tn5转座体稀释产物的建库效率与商品化Tn5试剂盒相当。4.用未纯化、纯化后及标准文库构建试剂盒分别对少量RAW264.7细胞进行RNA-seq建库分析,测序文库送样测序。测序结果显示,超滤纯化的Tn5转座体可以有效减少非特异性扩增,大幅减少无效Reads,并且发现基因数是传统方法的2倍(P<0.05),显著提高了测序文库质量。结论:1.优化表达后的Tn5转座酶,通过Ni-NTA亲和纯化,可进一步提高蛋白纯度,减少了其中核酸及非特异蛋白的污染。2.利用蛋白浓缩管超滤纯化后的Tn5转座体,选择性留下大分子量的SUMO-Tn5蛋白复合体,过滤去除小分子量的Tn5 ME序列,可以有效降低体系中ME干扰,提高Tn5转座酶在少量细胞中的建库效率。