背景和目的:粘膜相关淋巴组织结外边缘带B细胞淋巴瘤(extranodalmarginalzone B cell lymphoma of mucosa associated lymphoid tissue)简称为MALT淋巴瘤,约占非霍奇金淋巴瘤的8％,是最常见胃肠淋巴瘤,也可发生于其他部位,如眼附属器,肺,甲状腺等。MALT淋巴瘤的病因主要有两类,一类为细菌感染或慢性炎症,如幽门螺旋杆菌感染、桥本氏甲状腺炎和肌上皮涎腺炎等；另一类主要由染色体易位导致的基因异常,目前主要的染色体异位有:(1)t(11；18)(q21；q21)染色体易位导致API2-MALT1融合基因形成并高表达,约发生于20～40％的MALT淋巴瘤；(2)t(1；14)(p22；q32)染色体易位将1p22上的BCL10转移到14q32上的IGH增强子下游而高表达,发生于4～9％的MALT淋巴瘤；(3)t(14；18)(q32；q21)染色体易位将18q21的MALT1基因转移到14q32上而导致其高表达,发生于10％的MALT淋巴瘤；(4)t(3；14)(p14.1；q32)染色体易位将第3号染色体上的FOXP1基因转移到第14号染色体上而导致其高表达,这种染色体易位罕见,目前相关研究较少。绝大多数由细菌感染或慢性炎症引起的MALT淋巴瘤可用抗菌和抗炎治疗而治愈,但由染色体易位而导致的MALT淋巴瘤对这些治疗无效,为难治性肿瘤。目前发现这些染色体异位所致的肿瘤基本都有BCL10高表达,正常情况下BCL10在胞浆表达,但在t(11；18)和t(1；14)的病例中BCL10在核内也高表达,显示BCL10蛋白对难治性淋巴瘤的发病和恶性表型具有重要作用。　　 为研究BCL10蛋白高表达的致瘤分子机理,本课题组制备了Eμ—BCL10转基因小鼠模型。我们前期的研究发现MALT淋巴瘤的前体细胞-边缘带B细胞在体内增生,NF-κB通路被激活(Blood.2009；114:4158-4168)；同时这些增生的边缘带B细胞在体外培养中显示出抗凋亡特性。本课题组的前期结果还发现增生的边缘带B细胞中caspase8和caspase3的活性被抑制。本研究拟通过鉴定BCL10转基因杂合子与纯合子小鼠中的BCL10蛋白的表达增加,进一步研究BCL10蛋白量与边缘带B细胞增生和抗凋亡的量效关系,以揭示BCL10蛋白高表达对该肿瘤发病的直接关系,并研究其抗凋亡的分子机制。　　 方法:PCR鉴定Eμ-BCL10转基因小鼠；应用磁珠分选系统阴性分选脾脏细胞边缘带B细胞,流式细胞仪分析边缘带B细胞增生与BCL10蛋白表达量之间的量效关系。Western Blot检测野生型(WT)、Eμ-BCL10转基因杂合子小鼠(Tg/+)和Eμ—BCL10转基因纯合子小鼠(Tg/Tg)的内源性BCL10和转基因BCL10蛋白表达水平；我们前期研究发现高表达的BCL10蛋白使增生的边缘带B细胞在体外对抗Anti-IgM诱导的凋亡,而不保护Anti-Fas,γ-射线和地塞米松等诱导的凋亡,本次实验我们进一步鼠尾静脉注射Anti-IgM(80μg/只)观察高表达的BCL10是否对边缘带B细胞具有体内抗凋亡特性；就其抗凋亡分子机理,我们用免疫共沉淀分析BCL10、caspase8和API2蛋白的相互作用；Western Blot方法检测caspase8和API2的蛋白表达。　　 结果:本实验室前期研究结果显示,转基因纯合子小鼠中BCL10转基因蛋白(Flag-BCL10)约为杂合子小鼠中BCL10转基因蛋白的两倍,边缘带B细胞的增生程度与BCL10蛋白表达量呈量效关系。并且caspase-8和caspase-3的活性抑制随着BCL10蛋白量的增加而增加,提示这种边缘带B细胞的增生可能由于BCL10蛋白对caspase-8活性抑制而导致抗凋亡引起。本研究用抗BCL10抗体定量了BCL10蛋白在野生型FVB小鼠、Eμ-BCL10杂合子和纯合子小鼠中的蛋白表达量,表明内源性的BCL10蛋白在三种小鼠表达量一致,由此我们得到BCL10总蛋白表达量在三种小鼠的比值是FVB:Tg/+:Tg/Tg=1:2:3；并证明边缘带B细胞在这三种小鼠脾脏B细胞中的比例分别约为30％,50％和70％。通过鼠尾静脉注射Anti—IgM体内诱导边缘带B细胞的凋亡,证明高表达的BCL10蛋白抵抗这种处理所诱导的凋亡。免疫共沉淀(co-IP)研究证明BCL10蛋白与caspase-8和API2蛋白共沉淀,提示BCL10可能通过将凋亡抑制蛋白API2与caspase-8连接到一起而抑制caspase-8的激活从而导致边缘带B细胞抗凋亡。Western Blot研究显示caspase-8的蛋白表达量在这三种小鼠中没有明显改变,但凋亡抑制蛋白API2表达量随着BCL10蛋白的增加而增加,这种增加可能是由于BCL10高表达所导致的NF-κB的激活所引起。　　 结论:成功鉴定出Eμ-BCL10转基因杂合子和纯合子小鼠,并证明BCL10蛋白量在三种小鼠中的比值为FVB:Tg/+:Tg/Tg=1:2:3；随着BCL10蛋白量的增加,MALT淋巴瘤前体细胞.边缘带B细胞发生增生,其比例从正常野生型小鼠中占脾脏B细胞的30％增加到杂合子小鼠的50％和纯合子小鼠的70％,直接证明BCL10蛋白表达量与MALT淋巴瘤的发生具有量效关系。通过鼠尾静脉体内注射Anti-IgM诱导边缘带B细胞的凋亡,证明高表达的BCL10蛋白保护边缘带B细胞抵抗这种刺激所诱导的凋亡,而对其他凋亡诱导处理(如Anti-Fas,γ-射线和地塞米松)无效,证明BCL10是通过BCR通路发挥抗凋亡作用。API2是已知的抗凋亡蛋白,蛋白免疫共沉淀(co-IP)研究证明BCL10蛋白与caspase-8和API2相互作用,显示这三个蛋白在一个蛋白复合体中。Western Blot方法证明API2蛋白表达在转基因小鼠中随着BCL10蛋白的增加而增加,由于API2为NF-κB的下游基因,这种效应可能是由于BCL10高表达所导致的NF-κB激活的结果。综上所述,我们提出了如下MALT淋巴瘤的发病分子机理:BCL10高表达激活NF-κB而导致凋亡抑制蛋白API2的高表达,BCL10蛋白又将高表达的API2蛋白与caspase-8结合到一起导致caspase-8活性抑制,从而导致边缘带B细胞抗凋亡而发生MALT淋巴瘤。　　 背景和目的:DNA低甲基化在白血病中是普遍现象,但至今机理不明。本课题所研究的PASG基因已被证明与DNA甲基化相关,敲除该基因导致全基因组低甲基化,并且在所有已检测的各种白血病病人(B细胞,T细胞,髓细胞急慢性白血病)中发生丢失25个氨基酸的突变(PASG(-25)),而在正常人群或其他肿瘤中没有检测到这种突变。这是目前唯一一个与DNA甲基化有关的基因被发现在几乎所有被检测的白血病病人中突变,推测其可能是白血病中广泛的DNA低甲基化的原因。我们前期的体外研究结果显示,PASG与DNA甲基转移酶1(DNMT1)和PCNA在DNA复制叉(DNA replication foci)形成蛋白复合体,并能增加DNMT1酶活性,而PASG(-25)尽管通过与PCNA相互作用而仍然位于DNA复制叉,但却失去增加DNMT1酶活性的作用,提示这种发生于白血病中的突变(PASG(-25))起到正常PASG功能拮抗剂的功能(dominantnegative),从而导致白血病中的DNA低甲基化。本研究拟用EμSRα载体构建Eμ-PASG(-25)转基因小鼠模型,并构建Eμ-PASG(WT)转基因小鼠为对照,以从体内证明PASG(-25)是否能导致DNA低甲基化,并进而引起白血病的发生。　　 方法:(1)重组载体的构建和鉴定:用PCR方法获得PASG(WT)及PASG(-25)目的基因,并通过引物在5’端加入MluⅠ和3’端加入NheⅠ酶切克隆位点,同时在两端分别加入Flag和HA标签(tag),在EμSRα载体上多克隆位点也加入这两个酶切位点,分别用这两种酶切割PCR产物与载体,并进行连接,转化感受态细胞后,挑选阳性克隆,提取质粒,酶切和测序鉴定。每个转基因载体选择两个测序正确的克隆转染COS7细胞,分别用anti—Flag和anti-HA单克隆抗体鉴定克隆的蛋白表达。(2)转基因祖鼠(founder)的获得:将鉴定正确的转基因质粒送往南京大学模式动物研究所和中国医学科学院实验动物研究所进行转基因显微注射,剪取鼠尾提取基因组DNA,用PCR方法鉴定转基因是否在基因组中整合；(3)转基因蛋白的表达鉴定:每个founder扩增子一代(F1)鼠,鼠尾基因组DNA鉴定转基因是否阳性,阳性F1鼠用RT-PCR方法鉴定转基因mRNA的表达,用anti-Flag和anti-HA单克隆抗体进行Western Blot检测脾细胞转基因蛋白的表达。(4)PASG真核表达蛋白的制备:选用Invitrogen公司的BaculoDirect真核蛋白表达系统表达PASG蛋白,以期用于抗PASG单克隆抗体的制备,用于后续PASG体内蛋白复合体的研究。具体实验方法依试剂盒说明书进行。　　 结果:两次成功构建转基因载体,经转基因微注射后获得Eμ-PASG(WT)和Eμ-PASG(-25)转基因祖鼠共100只。(1)第一次构建Eμ-PASG(WT)和Eμ-PASG(-25)的载体,在5’端加入HA标签,3’端加入Flag标签,并保留原基因的启动密码子(ATG),测序鉴定正确,转染COS7细胞后蛋白表达良好。分别在南京大学模式研究所进行转基因注射2次,中国医学科学院实验动物研究所转基因注射1次,鉴定出转基因基因组整合的founder鼠野生型49只,突变型37只。它们的子一代(F1)约有一半有基因组整合的转基因,符合遗传规律,说明转基因注射成功。但只有两个Eμ-PASG(WT)的Founder子代鼠鉴定到转基因mRNA的表达,其他均未检测到,所有Founder的子代鼠均未检测到转基因蛋白的表达。(2)经请教转基因专家中国医学科学院实验动物研究所张连峰所长,将转基因载体进行改建,去除原基因的启动密码子并将Flag标签移到5’端,HA标签移到3’端,经转染COS7细胞证明重新构建的载体良好表达正确的蛋白。随后在中国医学科学院实验动物研究所进行2次转基因注射,共得到PASG野生型和突变型转基因Founder鼠14只,但仍只鉴定到2只野生型转基因鼠表达转基因mRNA,所有founder仍然未鉴定到转基因蛋白的表达。(3)成功使用BaculoDirect系统表达了PASG蛋白。　　 结论:两次成功构建Eμ-PASG(WT)和Eμ-PASG(-25)转基因载体并用转染COS7细胞的方法证明载体构建正确,在体外表达良好。多次成功进行转基因微注射,共得到基因组整合转基因的Founder鼠野生型55只,突变型45只,所有Founder鼠都用RT-PCR的方法鉴定mRNA的表达及免疫沉淀(IP)和western Blot的方法鉴定转基因蛋白的表达,除4个野生型Founder中鉴定到mRNA的表达外,其他所有Founder都未检测到mRNA的表达,并且所有Founder都未检测到转基因蛋白的表达。成功使用Baculo Direct系统表达了PASG蛋白,为后续的单克隆抗体研制奠定了基础。