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红花Carthamus tinctorius L.素有“亚油酸之王”美誉,普通型红花籽油中亚油酸含量可达70%以上。亚油酸(Linoleic acid,LA,C18:2Δ9,12)是植物细胞膜重要组成部分,参与植物抵御外界多种胁迫,也是多种信号分子合成的前体物质。亚油酸属人体必需脂肪酸,可降低血液粘稠度及甘油三酯含量,还可预防心脑血管疾病等。其生物合成由一系列脂肪酸合成及脱氢酶催化完成,其中ω-6脂肪酸脱氢酶（包括FAD2和FAD6）在催化油酸(Oleic acid,OA,C18:1Δ9)碳链Δ-12位脱氢生成亚油酸过程中起关键作用。红花籽油中高亚油酸及极低的饱和脂肪酸含量为目前已知油料作物中所特有,因此,对红花ω-6脂肪酸脱氢酶基因的功能及调控机制进行探究具有重要意义。本文主要研究结果如下:1.观察红花种子发育过程中大小形态变化,对其脂肪酸含量变化进行动态分析,发现其花后14～18 d（Day After Flower,DAF）总脂肪酸及亚油酸含量处于迅速累积阶段。选择亚油酸合成关键时期（10、14、18和22 DAF）进行转录组测序分析,共鉴定到255个差异unigenes参与红花籽粒脂肪酸生物合成和三酰甘油酯组装。多数参与脂肪酸从头合成unigenes在10～14 DAF具较高表达水平,18 DAF表达水平则下降。仅Ct SAD和CtFAD2-1基因的m RNA在18 DAF红花种子中大量累积。试验还鉴定出13个在上述时期表达水平变化与CtFAD2-1显著正相关的候选转录因子。选择12个脂肪酸生物合成途径关键酶基因进行定量PCR验证,发现这些基因在种子上述四个时期的动态表达模式与转录组测序结果基本一致,说明转录组测序结果较为可靠。2.基于转录组测序,选择15个表达量合适且在种子四个不同发育时期相对稳定表达基因作候选内参基因,分析其在红花不同发育时期种子、不同组织部位、不同材料、不同胁迫（盐胁迫和低温）及不同激素处理（脱落酸、赤霉素及多效唑）下的表达水平变化,并分别采用ge Norm和Norm Finder软件进行稳定性评价。结果发现在所有处理情况下,EF1、UBCE2、EIF5A、ATPS和60SRPL10最稳定,而MBF1和MFC最不稳定;针对不同处理组,也分别筛选得到对应最稳定的内参基因。3.红花据其籽油亚油酸含量不同,可划分为高、中、低亚油酸型。FAD2酶在红花种子亚油酸形成过程中起重要作用,目前红花中共检测到11个CtFAD2基因家族成员,经鉴定CtFAD2-1、CtFAD2-2、CtFAD2-10和CtFAD2-11具油酸脱氢酶活性。基于课题组前期研究发现CtFAD2-1基因序列在低亚油酸材料中因单碱基突变导致酶失活,本试验对除CtFAD2-1外其余三个CtFAD2家族成员在15份不同亚油酸型材料中序列差异进行分析,发现CtFAD2-2基因序列高度保守,而CtFAD2-10和CtFAD2-11序列形成2种单倍型,但功能分析发现两种单倍型未造成蛋白活性显著差异。基因表达水平分析发现CtFAD2-1表达模式在高低亚油酸类型材料中差异显著。高亚油酸型材料中CtFAD2-1基因在10 DAF表达量极低,14～18 DAF迅速增加;低亚油酸型材料中CtFAD2-1在10 DAF表达量极低,且在10～18 DAF表达水平也仅为小幅度增加。CtFAD2-2、CtFAD2-10和CtFAD2-11表达水平变化模式在两种类型材料种子的各发育时期均相似,其中CtFAD2-2和CtFAD2-10表达水平在各时期均较低,CtFAD2-11在10 DAF表达量较高,后急剧下降。据此认为,CtFAD2-2、CtFAD2-10和CtFAD2-11不是控制红花种子发育中后期亚油酸含量迅速累积的主效基因。4.克隆并获得红花全长CtFAD6基因序列并对其进行功能分析,发现CtFAD6酶能催化棕榈油酸（16:1）和油酸（18:1）分别生成16:2和18:2,且具有选择16:1脂肪酸作为底物的偏好性。本试验还探究了苗期红花营养组织（根、茎、叶）中各ω-6脂肪酸脱氢酶基因（CtFAD2和CtFAD6）对不同温度变化及盐胁迫的响应情况,发现低温、高温和盐胁迫可在转录水平上调节ω-6脂肪酸脱氢酶基因。红花不同组织中的ω-6脂肪酸脱氢酶基因对温度响应模式存在显著差异,主要在叶片被强烈诱导。与低温胁迫响应情况不同,CtFAD2-1、CtFAD2-11和CtFAD2-10在盐胁迫2 d后可被诱导,且根、茎和叶三个组织中都有不同程度基因表达水平提高。5.克隆了在发育中后期红花种子中高表达的CtFAD2基因拷贝CtFAD2-1基因5"-UTR区,内含子及1116bp启动子序列,并针对其中821bp启动子区进行深入探究。序列分析揭示其含低温、高温、MBS位点、多个光及激素响应元件,四个W-box及2个E-box元件。功能分析表明CtFAD2-1基因启动子可促进GUS基因在转基因拟南芥除种子外多个组织中表达,包括花序、果荚及种子萌发后10 d左右幼苗。且-230～-60bp为该启动子维持活性的最小功能区,而在-230～+121 bp区,除不包含热胁迫响应元件（HSE）,几乎包含所有预测诱导元件。分析CtFAD2-1基因启动子受温度、盐胁迫及其他非生物胁迫响应情况后,发现该启动子除响应低温、高温及盐胁迫长时间处理外,对ABA处理、损伤以及干旱胁迫也有响应,其中对损伤更为敏感,缺失分析表明P3启动子包含的2个w-box可能是决定CtFAD2-1基因启动子受损伤诱导的关键元件。6.基于转录组测序分析结果,在13个与CtFAD2-1表达水平有显著相关性转录因子中选择了1个含AP2结构域,1个含HSF结构域转录因子,分别命名为Ct ERF1B,和Ct HSFA6。另选1个在10 DAF有较高表达水平转录因子,命名Ctb HLH128。将三个候选转录因子克隆其ORF全长序列后,生物信息分析发现其均属核定位基因。分别对其在拟南芥中进行稳定过表达,并检测转基因阳性T2代株系种子脂肪酸组成及含量变化,结果发现转Ctb HLH128基因拟南芥种子总脂肪酸含量及主要不饱和脂肪酸含量均较野生型有大幅度提高,而转另两个转录因子的拟南芥种子与野生型比变化相对较小。试验还发现在15%PEG中,过表达Ctb HLH128基因的拟南芥株系较野生型拟南芥具有更高的萌发率,而Ctb HLH128基因促进油脂累积及提高干旱条件下种子萌发分子机理还需进一步深入探究。综上,CtFAD2-1在种子发育后期高表达,使红花籽油中亚油酸大量累积,是形成红花籽油亚油酸相对水平远高于其他油料作物的主要原因。而CtFAD2-1启动子可受多种非生物逆境调控,CtFAD2基因在红花营养组织中也参与对温度和盐胁迫的响应,可能是红花具有良好抗逆性原因之一。