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【背景】胃癌(Gastric Cancer,GC)是全世界最常见恶性肿瘤之一,常表现为发病率高、死亡率高。GC是个异质性较高的疾病,目前用传统组织病理学对胃癌进行分类已不能完全满足临床需要,2014年癌症基因图谱计划组(TCGA),将GC划分为4个亚型,其中AT丰富结合域1A基因(the AT-rich interactive domain 1A,ARID1A)在2组亚型(EB病毒相关型GC、微卫星不稳定型GC)中高频突变,且学者研究提出将ARID1A突变作为GC发生的因素之一。ARID1A作为染色质重塑复合物重要一员,在胚胎发育、组织生长、细胞增殖、分化、凋亡及起重要作用,可调控DNA合成、基因转录及DNA损伤后修复。研究表明,ARID1A在多种肿瘤中存在突变,其中胃癌的突变率是8-27%,该基因突变常可导致蛋白表达缺失或下降,与肿瘤进展、血管浸润、淋巴结转移相关,也是预测该类型肿瘤预后不良的因素之一。目前对胃癌的综合治疗仍以化疗为主,但不少患者在治疗过程中常因药物敏感性下降或耐药,导致疾病进展、转移。Lyu等研究发现,沉默ARID1A后卵巢透明细胞癌对顺铂的敏感性下降。而目前在胃癌的一线化疗方案中,以铂类为基础的联合方案是胃癌辅助化疗、姑息化疗的优选方案之一。故本研究拟通过sh RNA慢病毒转染胃癌细胞,沉默ARID1A基因,探讨ARID1A对胃癌细胞生物学及对奥沙利铂敏感性的影响。【目的】通过慢病毒转染胃癌细胞株,构建稳转ARID1A基因沉默的胃癌细胞株模型,探讨ARID1A基因沉默对胃癌细胞生物学行为,以及对胃癌细胞奥沙利铂敏感性的影响,并初步探讨导致胃癌细胞对奥沙利铂抵抗的可能机制。【方法】1.通过q PCR及Western blot法检测胃癌细胞中ARID1A的表达。2.通过慢病毒(载有特定靶向于人ARID1A基因的sh RNA及绿色荧光蛋白基因),转染胃癌细胞株MGC803、AGS,并用嘌呤霉素进行筛选,筛选出基因沉默的稳转胃癌细胞株。经由荧光显微镜和Western blot法从荧光表达量及蛋白表达水平验证ARID1A基因沉默效果。3.应用CCK8法、流式细胞仪及Transwell法,检测沉默ARID1A基因后,胃癌细胞株增殖活性、细胞凋亡、细胞周期分布及细胞侵袭能力等生物学行为的变化。4.采用CCK8法,检测ARID1A基因沉默组和阴性空载体胃癌细胞对奥沙利铂敏感性;采用流式细胞仪检测,同一奥沙利铂浓度下,ARID1A基因沉默组和阴性空载体胃癌细胞凋亡率。5.应用Western blot法检测,加入奥沙利铂前后,胃癌细胞AKt蛋白表达以及同一奥沙利铂浓度作用48h后,阴性对照组及ARID1A基因沉默组胃癌细胞AKt蛋白表达。【结果】1.ARID1A在胃癌细胞株MGC803,AGS中均有表达。2.成功构建的ARID1A沉默的稳转胃癌细胞株,荧光显微镜结果显示,在转染72h后,ARID1A沉默组胃癌细胞株MGC803、AGS的细胞荧光表达在80%以上;Western blot结果显示:与阴性空载体组相比,基因沉默组胃癌细胞ARID1A蛋白表达下调(AGS胃癌细胞蛋白表达下调65%,MGC803胃癌细胞蛋白表达下调40%),(P<0.01)。3.CCK8法结果显示:在细胞种板后早期(24h内),ARID1A基因沉默组与阴性空载体组之间的胃癌细胞增殖活性有增高趋势,但差异无统计学意义(P>0.05);在细胞种板后的24h-72h间,ARID1A基因沉默组胃癌细胞的增殖活性高于阴性空载体对照组(P<0.05)。流式细胞仪结果显示,ARID1A基因沉默组胃癌细胞较阴性空载体组细胞凋亡率下降(5.12±1.09 VS 8.76±1.02)(P<0.05);细胞周期结果显示:与阴性空载体组相比,ARID1A基因沉默组胃癌细胞周期分布表现为更多的细胞进入S期,G1期细胞减少(P<0.05)。Transwell侵袭实验结果显示,与阴性空载体组相比,ARID1A基因沉默组细胞侵袭能力明显增加(P<0.01)。4.CCK8法结果显示:在奥沙利铂浓度为(4μg/ml,8μg/ml,12μg/ml,16μg/ml)时,与阴性空载体组相比,ARID1A基因沉默组胃癌细胞的抑制率下降,(P<0.01);在奥沙利铂浓度为(1μg/ml,2μg/ml)时,与阴性空载体组相比,ARID1A基因沉默组胃癌细胞的抑制率变化不明显,差异无统计学意义(P>0.05)。流式结果显示:在同一奥沙利铂浓度作用下,ARID1A基因沉默组胃癌细胞的凋亡率低于阴性空载组(10.63±1.15 VS 19.05±2.45)(P<0.05)。5.Western blot结果显示,在AGS、MGC803细胞株中,在加入奥沙利铂作用48h后,奥沙利铂组胃癌细胞较不加药组Akt蛋白表达下调;在同一奥沙利铂浓度作用48h后,ARID1A基因沉默组胃癌细胞Akt蛋白表达较阴性空载体组表达上调(P<0.01)。【结论】1.ARID1A基因沉默后,胃癌细胞增殖活性增加,细胞凋亡减少,更多细胞进入S期,且细胞侵袭能力增加。2.ARID1A基因沉默后,胃癌细胞对奥沙利铂的敏感性降低。3.ARID1A基因沉默后,胃癌细胞对奥沙利铂的敏感性降低,可能与细胞Akt信号通路改变有关。