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脑胶质瘤是脑肿瘤中最常见的恶性肿瘤,是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一。据全国肿瘤防治办公室最近发表的统计结果,脑肿瘤调整死亡率列为第十位主要恶性肿瘤,在大城市的发病率男性女性均为第十位。尽管近年来随着影像学的发展胶质瘤的诊断、治疗有了长足的进展,但其总体疗效并无明显改善,手术后5年生存率仍徘徊在6%左右。首先,若能提高胶质瘤术前诊断率,尤其是提高术前定性诊断,将十分有助于有些胶质瘤的术前放疗或其他治疗、以及对手术范围的预先估计等,从而提高其总体治疗效果。另外,胶质瘤的病理分级是影响预后的最主要的因素之一,若能在术前明了胶质瘤的病理分级,将对医生术中决定手术的切除范围及对胶质瘤预后的判定提供参考。最后,众所周知,胶质瘤的复发是影响胶质瘤预后的最重要的因素之一,对胶质瘤复发的监测目前为止尚无一种理想的方法,因此若能对胶质瘤的复发进行进行早期检测,有助于对复发患者再次手术或对术后的辅助治疗进行合理选择,从而提高胶质瘤患者的总体生存率。 目前,在胶质瘤的定性诊断、预后的估计、复发早期检测中均存在着一定的困难。胶质瘤术前定性诊断和复发检测的方法主要依赖影像学检查,但迄今为止效果远不能令人满意,而且存在着X线的损伤和昂贵的费用问题。现阶段缺乏在术前估计肿瘤恶性程度的行之有效的方法,影像学、相关癌基因或肿瘤标记物的检测都存在假阳性率及假阴性率高的问题,迄今为止尚无一种理想的肿瘤标志物可以担当此任。 蛋白质组学技术的飞速发展,使我们寻找新的肿瘤的标志物的有了崭新的平台,不但可以从血清、脑脊液、组织中筛选潜在的标志物作为鉴别肿瘤性质、判断预后、监测复发的指标,并可比较不同组织来源的标志物,若在不同组织中发现同样的标志物,则可以佐证标志物的肿瘤源性,并探讨胶质瘤可能的发病机制。 胶质瘤是一种多基因、多步骤、多阶段的复杂的疾病,包含了多个基因突变的分子事件过程,包括抑癌基因的功能丧失,癌基因的活化等,因此检测单一或数个指标对胶质瘤进行术前诊断、监测复发和预测预后,不可避免地存在敏感性和特异性矛盾。蛋白质组学能够识别鉴定细胞、组织或机体的全部蛋白质,提供了一组蛋白质的功能及其模式的信息,能够同时反映细胞内部的遗传特性和外界因素的影响的结果,因此深入研究恶性肿瘤的发生发展的过程,客观上需要在蛋白质组的水平进行进一步的探索。SELDI-TOF-MS(Surface Enhanced浙江大学博士研究生毕业论文Laser Desorptio胡onization一肠me ofr一ight-Mass speetrometry,表面加强激光解吸电离一飞行时间质谱)技术是最近几年才发展起来的一种新的蛋白质组学研究方法,由于SELDI蛋白质芯片技术的高灵敏度及高通量特性,能反映检测样本中蛋白质的全貌,从而同时找到多个蛋白质标志物。故希望利用血清和脑脊液筛选敏感特异的肿瘤标志物,为术前诊断、预后估计一、复发监测提供了可能;同时利用肿瘤组织标本和其配对的癌旁正常的组织(手术进路时破碎的脑组织)的蛋白质指纹图的差异比较,一则筛选潜在的胶质瘤标志物,二则为将来的标志物的分离和鉴定提供资源和工作基础。材料与方法1材料 1.1标本:105份血清:胶质瘤39例,其中I一n级18例,111一W级21例,复发8例; 脑良性肿瘤28例;健康对照28例;75份脑脊液:胶质瘤20例;脑良性肿瘤25例; 轻度脑外伤27例;12对(其中4对为复发胶质瘤)肿瘤及其自身手术进路破碎的正 常组织。 1.2设备:表面加强激光解吸电离一飞行时间质谱(Surface Enhaneed Laser Deso甲tioll八onization一T如e ofFlight-Mass spectrometry,sE功I一TOF一Ms),(pBS Ir, Ciphergen Ine.美国)。主要参数:收集范围为1000一50000;优化范围为2000一30000 (脑脊液为1000一2000)。 1.3芯片:H4为疏水性表面的化学芯片;WCX一2为弱阳离子结合芯片;IMAC为金属 鳌合的芯片;CM10为WCX一2改进型,其表面有一层疏水性的涂层,因此兼具WCX一2 和H4两种芯片的优点。 1.4应用软件和标志物评价指标:应用软件:SPsS 10.1软件:t检验;Cinhe电en Software 3.1和Bfomarker Wl乙对ds;人工神经网络:Matlab 6.5的NNToofs:支持向量机: osU--SVM 3.0工具箱;判别分析。评价试验的指标:灵敏度、特异度、Youden指数、 ROC曲线下面积。2方法2.1样本处理: 2.t.i血清:ug溶液处理血清;somMNaAC(pH=4)稀释;Bioproeessor(可含12根芯 片)结合反应60分钟;上述NaAC(pH二4)缓冲液清洗芯片;取出芯片风干后点50% 饱和的SPA溶液:上机读片。 3浙江大学博士研究生毕业论文 2.1.2脑脊液:等体积的0.5%cHAPs稀释标本;用20mM的HEPEs(pH7.4)将标本总 体积调至160ul;Bi叩rocessor结合反应60分钟;上述HEPES缓冲液清洗芯片;取出芯 片风干后点饱和的CHCA溶液;上机读片。 2.IJ组织:组织冰冻切片,95%酒精固定;每块组织同时做2张HE切片,依据HE阅片 结果在显微镜下划定并纯化组织细胞;U7裂解细胞;裂解后的样本用10OmM Na Acetate (pH4.0)稀释至30ul上样,反应60分钟;上述Na Acetate缓冲液清洗芯片;取出芯片 风干后点50%饱和的S队溶液;上机读片。2.2 SELDI操作: 原始数据先用ProteinchiP software3,