论文部分内容阅读
目的：建立体外分离、纯化和培养小鼠睾丸间质细胞(Ley dig cells, LCs)的方法,从氧化应激和线粒体电子呼吸链氧化磷酸化酶复合体相关基因表达水平的变化探讨硫酸镍对小鼠LCs线粒体损伤的可能机制。方法：(1)采用Ⅳ型胶原酶消化、Percoll密度梯度离心和贴壁培养法,提取和纯化小鼠LCs,用3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-hydroxysteroid dehydrogenase,3β-HSD)法对获得的LCs进行纯度鉴定。(2)LCs融合度达80～85%时,用硫酸镍(NiSO4)0、250、500和1000μmol/L处理24h,采用DCFH-DA探针法,荧光倒置显微镜观察LCs活性氧(ROS)的含量,采用磷钼酸比色法检测细胞内三磷酸腺苷(Adenosine-5’-triphosphate, ATP)含量。(3)采用实时荧光定量PCR和Western blot技术检测LCs线粒体电子呼吸链关键基因NADH-氧化还原酶-1(NADH dehydrogenase subunit1, ND1)、细胞色素-b (Cytochrome b, Cyt-b)和细胞色素氧化酶II (Cytochrome oxidaseII, COXII) mRNA及蛋白表达水平。结果：(1)经3β-HSD法鉴定,该提取方法可获得纯度达90%以上的LCs。(2) LCs经各浓度NiSO4处理24h后,NiSO4500和1000μmol/L浓度组LCs内ROS含量升高,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。NiSO4500和1000μmol/L浓度组LCs内ATP含量降低,与对照组比较差异有统计学意义(P,<0.05)。(3)实时荧光定量PCR和Western blot技术检测结果显示,NiSO4500和1000μmol/L浓度组,睾丸间质细胞内ND1、 Cyt-b和COX II的mRNA和蛋白表达量均降低,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论：建立了较理想的原代小鼠LCs的分离、纯化和培养方法；硫酸镍可使原代培养小鼠LCs内ATP含量降低,可能与其提高小鼠LCs内ROS水平,降低线粒体内电子呼吸链关键基因ND1、 Cyt-b和COX II mRNA和蛋白表达水平有关。