盐角草高亲和钾离子转运载体SeHKT基因克隆及其功能验证

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土壤盐渍化及钾元素匮乏成为影响植物生长发育的重要因素,而盐渍化环境对植物的伤害主要是离子毒害,调节植物内环境中离子平衡成为植物抗盐的重要措施。因此,与离子调节相关的转运蛋白正在被广泛关注,尤其是HKT类蛋白正受到研究者们越来越多的重视,其功能也逐渐被揭示。研究表明HKT类蛋白在调节植物细胞内稳定的K+/Na+比、Na+/K+的吸收及Na+长距离转运等植物的耐盐性中起着重要作用。然而,目前报道的HKT基因大都来自非盐生植物,包括小麦TaHKT1、拟南芥AtHKT1、水稻OsHKT系列等,对于盐生植物HKT类蛋白特性及功能研究的数据却非常有限。本实验以典型的盐生植物盐角草为实验材料,目的是进一步揭示HKT类转运蛋白在盐生植物中的耐盐机制,并克隆得到其cDNA,以期获得可以提高转基因植株的耐盐能力。   本实验通过生理生化方法研究了盐角草在不同盐分胁迫下的生理生化变化表明,一定浓度的NaCl溶液促进了盐角草的生长,200mmol/L左右是其生长的最适浓度,500mmol/L和800mmol/L高盐浓度会对盐角草的质膜、酶系统等造成不同程度的伤害;对K+、Na+含量测定显示盐角草体内Na+含量在10mmol/L就可达455.16mmol/g,一些基因的荧光定量分析也表明K+/Na+的吸收和调节对盐角草的高耐盐特性具有重要贡献。   利用RACE技术克隆得到盐角草SeHKT1、SeHKT2 cDNA,分别得到全长为1653bp,编码550个氨基酸,1611bp,编码536个氨基酸。生物信息学及分子系统进化树分析表明,SeHKT1与SeHKT2可能在盐角草中的耐盐机制中分别发挥着独特的功能。   实时荧光定量qRT-PCR对SeHKT1、SeHKT2基因时空表达模式进行分析发现,两个基因在K+/Na+吸收和运输特性上分别具有独特的功能,SeHKT1主要在根中表达,可能参与调控根部K+/Na+吸收,SeHKT2则主要在地上部表达,在根中表达相对较少,可能参与盐角草地上部K+/Na+的分布,进一步证明了SeHKT1与SeHKT2在盐角革根与地上部对于Na+/K+的调节分别发挥着不同的功能。   SeHKT1及SeHKT2蛋白在酵母突变体R5421中的互补功能分析证明,SeHKT1主要介导高亲和K+的吸收,SeHKT2可能介导低亲和的钾离子吸收,这为两者在盐角草根与地上部中调节K+/Na平衡发挥着不同作用提供了有力证据。同时,对转化子在酵母突变菌株G19中进行了Na+吸收特性的研究显示SeHKT1与SeHKT2的过表达提高了酵母突变菌株的耐盐性,降低了对Na+的敏感性,说明SeHKT1与SeHKT2不介导或介导很弱的Na+吸收。
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