RhoA分子在登革2型病毒感染过程中的作用研究

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登革病毒(dengue virus,DV)属于黄病毒属、是一种包膜的单股正链RNA病毒。根据包膜蛋白的抗原性不同,可将登革病毒分为四个血清型,即DV1~4。DV以蚊虫为主要传播媒介广泛流行于热带和亚热带地区。每年,登革病毒会导致数百万人感染,引起登革热(dengue fever,DF)和登革出血热/登革休克综合症(dengue hemorrhagic fever/ dengueshock syndrome, DHF/DSS)。DF是自限性发热性疾病。而DHF/DSS则是威胁患者生命的重症,其主要特征是血管通透性显著增加,导致血浆渗漏。每年大约有50万DHF/DSS患者,如未及时治疗,病死率可上升至50%。因而对其致病机理和预防手段的研究已成为亟待解决的前沿课题。研究表明,宿主细胞骨架在病毒的感染过程中发挥重要作用,而构成细胞骨架的主要成分微丝、微管、中间纤维在不同病毒的感染过程中分别扮演着不同的角色。我们小组前期实验证实微丝和波形蛋白纤维在DV的感染及复制过程中发挥着重要作用。DV的感染可以引起微丝骨架的改变,用微丝药物破坏其聚合和解离的平衡,可以导致DV感染受到抑制说明微丝聚合和解离的平衡对DV的感染具有重要意义。而调节微丝骨架的关键因子是Rho GTP酶,作为分子开关Rho GTP酶在无活性的GDP和有活性的GTP两种形式间循环,调节细胞的形态、生长、运动以及细胞周期等。Rho GTP酶家族中研究的比较多的有3个成员:RhoA、Cdc42和Rac1。我们对波形蛋白纤维的研究发现,ECV304细胞在感染DV2后,细胞中的波形蛋白会发生重排,重排的波形蛋白从细胞边缘回缩、环绕于细胞核周围,并与病毒抗原共存,用丙烯酰胺长时间作用细胞后,破坏波形蛋白会影响DV2的复制增殖。目前研究发现波形蛋白纤维的重排是由激酶磷酸化所致,而RhoA及其下游激酶ROCK (Rho associated coiled-coil forming protein kinase)在波形蛋白纤维磷酸化中扮演着重要角色。为此,本课题以RhoA/ ROCK通路为研究对象,采用构建RhoA突变体及RhoA和ROCK特异性抑制剂干扰RhoA/ ROCK通路的方法,观察对DV感染与复制的不同环节的影响,从而为解析DV感染的分子机制提供理论依据,为预防和控制DV感染提供新思路。本研究的主要实验内容和结果如下:1.利用突变体观察RhoA功能的异常对DV病毒感染的影响本实验用DV2感染ECV304细胞及稳定表达RhoA突变体的ECV304细胞株:ECV304N、ECVWtRhoA、ECVV14RhoA和ECVN19RhoA(MOI=1),通过病毒噬斑计数法分别检测感染后1 h细胞内和24h细胞内外的病毒滴度。结果显示在病毒感染1小时后ECVN19RhoA、ECVWtRhoA、ECVV14RhoA细胞内的病毒滴度均低于ECV304和ECV304N,其中ECVV14RhoA、ECVWtRhoA下降比较明显,而ECVN19RhoA下降较少,相较于ECV304N的病毒滴度分别下降了49.71%、51.76%、20.59%。在病毒感染24小时后,细胞上清中的病毒滴度ECVV14RhoA、ECVWtRhoA和ECVN19RhoA均低于ECV304N和ECV304,其中ECVV14RhoA、ECVWtRhoA下降比较明显,而ECVN19RhoA下降不明显,相较于ECV304N的病毒滴度分别下降了76.6%、77.2%、23%;细胞内病毒滴度的变化与上清趋势相符,即ECVV14RhoA、ECVWtRhoA下降比较明显,而ECVN19RhoA下降不明显。相较于ECV304N的病毒滴度分别下降了58.75%、62.32%、20.29%。结果提示:RhoA功能的异常对DV2的感染有明显的抑制作用。2.利用C3转移酶抑制RhoA活性观察对DV感染的影响利用C3转移酶抑制ECV304细胞内RhoA活化后实施感染实验,收集病毒穿入细胞1 h时的细胞样本和感染后24 h培养上清及细胞样本进行病毒滴度检测,结果显示:药物组病毒穿入1h后细胞内的病毒滴度相较于对照组的病毒滴度下降了88.46%;药物组病毒感染24h培养上清和细胞内的病毒滴度相较于对照组分别下降了12.52%、82.35%。与免疫荧光及共聚焦显微镜观察到的结果相符,即药物处理组病毒抗原阳性的细胞数目明显低于对照组。结果说明抑制RhoA活化可明显抑制DV穿入宿主细胞及DV的复制增殖。3.采用G-lisa检测DV病毒感染过程中RhoA分子活性的变化用灭活DV2(56℃,30min)和DV2分别感染ECV304细胞。在感染30min,1h,8h及24时收集细胞样品,采用G-LISATM RhoA Activation Assay Biochem KitTM(Cytoskeleton)试剂盒检测胞内RhoA分子的活性。结果显示:在感染30min及1h时RhoA活性较对照组有显著升高,其中感染30min时最为明显,感染后1h开始下降。而在感染8h和24h后RhoA分子活性较对照组没有明显变化。说明RhoA活性主要在病毒穿入细胞的过程中被激活,而在病毒的复制增殖过程中没有变化。4.利用Y-27632抑制ROCK活性观察对DV感染的影响使用ROCK活性抑制剂Y-27632抑制ROCK活性后实施感染实验,收集感染后8 h和24 h培养上清和细胞样本进行病毒滴度检测,结果显示:与对照组相比药物处理组(6个浓度处理)细胞上清和细胞样本中病毒滴度均没有明显变化。与免疫荧光及共聚焦显微镜观察到结果一致,即药物处理组与对照组之间病毒抗原阳性的细胞数目没有明显差异。说明抑制ROCK活性对DV的复制增殖无明显影响。综上所述,RhoA在DV感染过程中具有重要作用,DV在进入ECV304细胞的过程中激活RhoA。上述实验结果为深入理解DV与宿主细胞的相互作用、阐明DV的致病机制提供了重要的实验依据。
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