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第一部分、草酸钙结石小鼠模型的构建及透明质酸相关基因在肾脏的表达 目的：应用简单的处理方法构建小鼠草酸钙结石模型。 方法：使用8周龄雄性的C57BL/6小鼠和BALB/C小鼠，每种小鼠均随机分为四组，每组小鼠每日接受药物腹腔注射，药物和剂量分别为80mg/kg乙醛酸、120mg/kg乙醛酸、140mg/kg草酸钠和210mg/kg草酸钠。每日观察小鼠生存状态，记录存活数量，并绘制不同药物处理组的生存曲线。每日记录各处理组小鼠的体重，绘制小鼠的体重变化曲线。每3天使用代谢笼收集小鼠24h尿液，离子色谱仪测定小鼠尿草酸24h排泄量。每3天处死3只小鼠，获取小鼠肾脏，肾脏切片行von Kossa染色，了解肾脏成石情况，并提取肾脏总RNA，real-time PCR检测透明质酸合成酶及CD44的表达。 结果：在C57BL/6小鼠中，80mg/kg乙醛酸组的生存曲线，显著优于120mg/kg乙醛酸组的生存曲线，140mg/kg草酸钠组的生存曲线也显著好于210mg/kg草酸钠组，80mg/kg乙醛酸组的生存曲线显著优于140mg/kg草酸钠组。在BALB/C小鼠中，80mg/kg和120mg/kg乙醛酸对小鼠生存的差异无显著性影响，但80mg/kg乙醛酸组的小鼠死亡数更少，140mg/kg草酸钠组的生存曲线显著优于210mg/kg草酸钠组，80mg/kg乙醛酸组的生存曲线显著优于140mg/kg草酸钠组。使用相同的药物，在C57BL/6和BALB/C之间生存曲线无显著性差异，但C57BL/6小鼠的中位生存期长于BALB/C小鼠。C57BL/6小鼠和BALB/C小鼠的体重变化均呈先下降后上升的趋势，并且80mg/kg乙醛酸组的体重变化最小。在乙醛酸腹腔注射小鼠中，C57BL/6小鼠的体重变化小于BALB/C小鼠。在腹腔注射期间，C57BL/6和BALB/C小鼠的24h尿草酸排泄量均升高，且肾脏表达HAS1、HAS2、HAS3、CD44表达也升高。肾脏内草酸钙晶体沉积与0-6天逐渐增加，6-18天逐渐减少至消失。 结论：乙醛酸和草酸钠均能诱导小鼠肾脏形成草酸钙晶体，其中80mg/kg乙醛酸腹腔注射对小鼠的生存和体重影响最小，并且C57BL/6小鼠作为模型优于BALB/C小鼠。 第二部分、透明质酸在草酸钙晶体形成中相关功能的体外和体内研究 目的：在体外和体内研究透明质酸在肾小管上皮细胞和草酸钙晶体间发挥的功能 方法：分别应用0.1mmol/L、1mmol/L、5mmol/L COM晶体与HK-2细胞培养，MTS法检测细胞增殖，ATP法检测细胞毒性，流式细胞仪检测细胞死亡，明确合适的用于细胞培养的COM晶体浓度。Western blots检测COM晶体对HK-2激活的信号通路；real-time PCR检测COM作用于HK-2细胞后HA相关基因的表达，HAELISA检测COM对HK-2细胞分泌HA的影响。应用p38和JNK信号通路抑制剂，real-time PCR检测信号通路对HK-2细胞HA相关基因的影响，并ELISA检测HA的分泌变化。应用HA合成抑制剂处理C57BL/6小鼠，同时行80mg/kg乙醛酸腹腔注射，在体内研究HA对草酸钙晶体肾脏沉积的影响。 结果：0.1mmol/L COM晶体即可引起HK-2细胞凋亡，但对细胞毒性和细胞增殖无明显影响；1mmol/L COM晶体可引起HK-2细胞增殖减慢，显著增加细胞毒性，并引起细胞凋亡和坏死；5mmol/L COM晶体可引起HK-2细胞大量死亡。COM晶体作用于HK-2细胞可激活p38 MAPK和JNK信号通路，并可使HAS1、HAS2、HAS3、CD44表达增加，同时HYAL1、HYAL3表达升高。P38抑制剂可使HK-2细胞可使HAS1表达下降，HYAL1、HYAL2、HYAL3表达升高；JNK抑制剂可使HK-2细胞HAS2、HAS3表达下降，HYAL1、HYAL3表达升高；HA抑制剂可使HAS1、HAS2、HAS3、CD44、HYAL3表达下降，HYAL1、HYAL2、HYAL4表达升高。P38抑制剂、JNK抑制剂、HA抑制剂均可使HK-2细胞分泌HA减少。HA抑制剂作用于草酸钙小鼠动物模型后，可使其肾脏内晶体沉积减少。 结论：COM晶体可激活p38、JNK信号通路，并介导HK-2细胞分泌HA，HA参与草酸钙晶体在肾脏的沉积。 第三部分、草酸钙晶体引起肾脏局部炎症反应的初步研究 目的：研究COM引起的肾脏局部损伤和炎症。 方法：通过COM与HK-2细胞培养，LDH法检测细胞损伤，并研究HA抑制剂对细胞损伤的影响；ELISA检测HK-2细胞IL-1β的分泌，并研究HA抑制剂对细胞炎症的影响。在大鼠草酸钙结石模型中研究肾脏巨噬细胞浸润情况，明确是否存在肾脏炎症。体外分离培养小鼠骨髓源巨噬细胞，并流式细胞仪鉴定其细胞表面标志。将巨噬细胞体外分化为M1和M2，免疫荧光和real-time PCR鉴定细胞标志，并ELISA检测不同表型巨噬细胞的IL-1β和CCL2的分泌情况。体外M1、M2相互转化，real-time PCR检测M1及M2细胞标志。Real-time PCR检测COM及损伤标志分子ATP对巨噬细胞IL-1β表达影响，并ELISA检测其IL-1β的分泌。 结果：COM可引起HK-2细胞损伤和IL-1β分泌增加，而HA抑制剂可减轻细胞损伤并减少IL-1β分泌。在大鼠草酸钙结石模型肾脏切片中，可见大量巨噬细胞浸润，显著多于对照大鼠。体外分离小鼠巨噬细胞，流式细胞仪鉴定表面标志符合巨噬细胞表型，免疫荧光和real-time PCR鉴定M1和M2的标志也符合其相应表型。M1高表达IL-1β、TNF-α、CCL2、iNOS，低表达MR、MSR、ARG，M2高表达MR、MSR、ARG，低表达IL-1β、TNF-α、CCL2、iNOS。M1分泌IL-1β和CCL2显著高于M0和M2。体外M1、M2相互转化，可使细胞同时表达M1和M2的部分标志。COM和及其损伤分子ATP均可使M1高表达IL-1β，并分泌IL-1β增加。 结论：在草酸钙大鼠模型中，巨噬细胞细胞浸润明显，COM和ATP可加重HK-2细胞损伤和炎症，并可加重M1的促炎症作用。