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目的:观察不同氧浓度对人牙髓干细胞(h DPSCs)增殖及神经分化的影响,选择最佳的低氧浓度预处理h DPSCs,并探讨低氧条件下预处理h DPSCs脑内移植,对缺氧缺血性脑损伤(HIBD)新生大鼠脑神经元自噬及自噬相关蛋白-7(ATG-7)的影响,为h DPSCs的临床应用提供理论依据。方法:健康7日龄Sprague-Dawley新生大鼠48只,随机分为假手术组(Sham组)、缺氧缺血性脑损伤组(HIBD组)、常氧预处理h DPSCs组(N-h DPSCs组)及低氧预处理h DPSCs组(H-h DPSCs组),各组根据移植后时间,分为移植后24 h及4 d两个亚组,n=6。无菌收集正畸减数牙或者第三磨牙,改良组织块联合酶消化法分离培养h DPSCs,细胞化学免疫荧光染色法检测细胞表面标记物CD34、CD90、CD146。选用1%、5%、10%及21%四个氧浓度预处理h DPSCs。Ed U细胞化学免疫荧光染色法检测细胞增殖,CCK-8法检测细胞活力,TUNEL细胞化学免疫荧光染色法检测细胞凋亡,采用显微镜观察h DPSCs神经诱导后的形态学变化,细胞化学免疫荧光染色法检测h DPSCs神经诱导后细胞巢蛋白(Nestin)的表达,通过上述方法,确立最佳h DPSCs低氧预处理浓度。采用经典Rice-Vannuis法制备新生大鼠HIBD模型,造模后24 h,经侧脑室移植N-h DPSCs与H-h DPSCs。移植后24 h,Neu N/P62、Neu N/LC3-II、Neu N/Beclin-1、Neu N/ATG-7免疫荧光双标法检测低氧预处理h DPSCs对HIBD新生大鼠损伤侧大脑皮层神经元自噬及ATG-7的影响;移植后4 d,苏木素-伊红(HE)染色法观察h DPSCs治疗对HIBD新生大鼠损伤侧大脑皮层组织病理学的影响;尼氏染色法观察h DPSCs治疗后HIBD新生大鼠损伤侧大脑皮层神经细胞数的变化。结果:(1)成功分离培养h DPSCs,细胞化学免疫荧光染色鉴定结果示,h DPSCs间充质细胞标志物CD90+、CD146+,造血干细胞表面标志物CD34-。(2)Ed U细胞化学免疫荧光染色结果示,体外培养6 h、12 h时,不同氧浓度之间h DPSCs增殖率无显著差异(P>0.05);体外培养24 h,5%O2条件下h DPSCs增殖率显著高于21%O2,1%O2和10%O2条件下h DPSCs增殖率亦显著高于21%O2,但低于5%O2(P均<0.05);培养72 h,5%O2条件下h DPSCs增殖率仍高于其他氧浓度(P<0.05)。(3)CCK-8结果示,培养24 h,5%O2、10%O2和21%O2条件下细胞OD值均显著高于1%O2,且5%O2细胞OD值显著高于21%O2(P均<0.05),10%O2和21%O2条件下细胞OD值差别无统计学意义(P>0.05)。(4)TUNEL细胞化学免疫荧光染色结果示,培养24 h,1%O2、10%O2和21%O2条件下凋亡细胞数均显著高于5%O2,且1%O2条件下凋亡细胞数显著高于21%O2(P均<0.05),10%O2和21%O2条件下凋亡细胞数无统计学意义(P>0.05)。(5)神经诱导5 d,不同氧浓度条件下细胞形态均诱导为神经元样,1%O2、5%O2及10%O2细胞突起数量均显著高于21%O2(P均<0.05),且5%O2细胞突起数量显著高于1%O2和10%O2(P<0.05)。(6)Nestin细胞化学免疫荧光染色结果示,神经诱导5 d,1%O2、5%O2、10%O2条件下FINestin显著高于21%O2,5%O2FINestin显著强于1%O2和10%O2,且10%O2FINestin显著强于1%O2(P均<0.05)。5%O2为h DPSCs最佳的氧诱导浓度。(7)h DPSCs侧脑室移植后24 h,H-h DPSCs组与N-h DPSCs组大鼠脑内大脑皮层神经元Beclin-1+、LC3-II+及ATG-7+细胞数显著低于HIBD组,且H-h DPSCs组显著低于N-h DPSCs组(P均<0.05),H-h DPSCs组与N-h DPSCs组大鼠脑内大脑皮层神经元P62+细胞数均显著高于HIBD组(P<0.05),且H-h DPSCs组显著高于N-h DPSCs组(P<0.05)。(8)HE染色结果示,HIBD组损伤侧大脑皮层神经细胞形态紊乱,排列无规律,N-h DPSCs组和H-h DPSCs组神经细胞排列较整齐,形态较规则,且H-h DPSCs组神经细胞排列较N-h DPSCs组更规则。(9)尼氏染色结果示,N-h DPSCs组和H-h DPSCs组损伤侧大脑皮层神经细胞数均较HIBD组显著增加,且H-h DPSCs组显著高于N-h DPSCs组(P<0.05)。结论:(1)低氧预处理可促进h DPSCs的增殖及其神经分化潜能,且5%O2条件下更易促进h DPSCs增殖及神经分化。(2)h DPSCs移植可减轻HIBD新生大鼠脑神经元自噬并抑制ATG-7的表达,进而减轻新生大鼠HIBD,发挥神经保护作用,其中,5%O2预处理h DPSCs移植的疗效优于常氧条件下培养的h DPSCs,更易减轻HIBD后大脑皮层神经元自噬,具有更好的神经保护作用。