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背景 胃癌是严重威胁我国人民健康的恶性肿瘤之一，常规疗法效果欠佳。免疫治疗是肿瘤治疗的未来方向之一，肿瘤疫苗又是肿瘤免疫治疗的一个活跃领域。胃癌MG7-Ag是全军消化病研究所发现的较好的胃癌标志物。它特异性高表达于胃癌组织，研究显示其抗原表位位于糖链上。在前期的研究中，我们应用噬菌体文库显示技术筛选得到了胃癌MG7-Ag的模拟表位多肽，实验证实该多肽能较好地模拟原始抗原。在此基础上，本实验室利用PCR技术构建了MG7-Ag模拟表位与载体蛋白HBcAg的融合表达载体，已证可以被减毒伤寒沙门氏菌正确表达，并能诱导出抗肿瘤免疫。 重组腺病毒作为疫苗载体有很多优点：可达到高滴度；能有效转染增殖和非增殖细胞；蛋白表达高；没有插入性突变的危险；腺病毒无包膜，不易被补体灭活。腺病毒载体被认为是基因治疗中很有前途的一种载体。 重组腺病毒作为疫苗载体安全有效，并可以活化DC，提高DC向局部淋巴结移动和呈递抗原给T细胞的能力，打破机体对肿瘤相关抗原的免疫耐受。与其他非病毒载体（如：质粒）相比，腺病毒可以更有效的进入细胞内，其表达的目的片段可同时通过MHC Ⅰ及Ⅱ类途径提呈，激活CD8+和CD4-T细胞，诱发强烈的免疫反应。 第四军医大学硕土学位论文 本研究中选用的腺病毒表达系统是由 Bert Vogelstein等构建的一种新型的重组腺病毒系统。它利用细菌内高效的同源重组系统，进行腺病毒的同源重组，提高了包装病毒的效率，方便含有目的基因重组体的鉴定。此外，该系统带有绿色荧光蛋白标签，可直接观测转染的效率和病毒感染的情况，因而是一种高效、便利的腺病毒重组系统。 异源性激发－加强接种对于增强疫苗的免疫效能是一种有效的措施。它是指初次免疫和随后的加强免疫采取不同的抗原载体或佐剂，以避免多次使用同一载体诱导机体对载体产生过强的免疫反应，减弱疫苗的兔疫效果。此接种策略已被广泛的应用于各种疫苗，病毒载体有较强的免疫原性，因而此策略尤其适用于以病毒为载体的疫苗。 目的 以复制缺陷的重组腺病毒为疫苗载体，构建胃癌MG卜Ag模拟表位的重组腺病毒疫茵，观察BALB／c小鼠免疫后诱导的体液和细胞免疫反应。采用胃癌MG7－Ag模拟表位DNA疫苗及重组腺病毒疫苗异源性激发．加强接种方法免疫BALB／。小鼠观察诱导的体液和细胞免疫反应。 方法 ＊)亚克隆MG7－Ag模拟表位与HBCAg的融合基因到腺病毒穿梭质粒 pAdTrackCMV上；C厉用 Pinel酶切线性化含有融合基因的pAdTrackCMV穿梭质粒，然后与腺病毒骨架质粒pAdEasyl电穿孔共转染ECOli BJ5183感受态菌，通过细菌ECOli BJ5183内的同源重组系统进行同源重组，构建成重组腺病毒质粒pAd－MG7；（3用 Pac酶切线性化重组腺病毒质粒，将线性化的重组腺病毒质粒pAd－MG，用Lipofectamine2000转入293细胞，包装出重组的腺病毒，即重组腺病毒疫苗；（）利用 PCR及 Western blot鉴定重组腺病毒的融合基因表达；（5）用构建的重组腺病毒疫苗免疫BALB／c小鼠，每隔2周加强免疫一次，以PBS和不带有目的片断的重组腺病毒接种小鼠作为对照，观察小鼠对疫苗的耐受情况；0乃周后应用ELISA法检测小鼠血清中抗MG卜Ag －3－ 第四军医大学硕士学位论文抗体的滴度，取免疫鼠的脾细胞，以’tr释放法检测小鼠脾淋巴细胞对靶细胞的杀伤效果，反映细胞免疫反应情况；（7）初次免疫9周后，用表达MG广Ag的小鼠艾氏腹水瘤细胞进行肿瘤攻击实验，观察疫苗对小鼠的保护作用；田用胃癌MG卜Ag模拟表位口服DNA疫苗及重组腺病毒疫苗，进行异源性激发－加强接种方法免疫BALB／C ’J’鼠，初次免疫用DNA疫苗，加强免疫用重组腺病毒疫茁；（9）9周后应用ELISA法检测小鼠血清中抗 MG广叭g抗体的滴度，用’℃r释放法检测小鼠脾淋巴细胞对靶细胞的杀伤效果，反映细胞免疫反应倩况；QO）初次免疫9周后，用小鼠艾氏腹水瘤细胞进行肿瘤攻击实验，观察疫苗对小鼠的保护作用。 结果 ＊)用 Pinel酶切重组腺病毒质粒 pAd－MG卜 能释放出约4．skb大小片段，而pAdEasyl用相同的酶切未释放片断，从而证明此质粒为重组的腺病毒质粒；（2）重组的腺病毒质粒用 PaC酶切线性化后，转染293细胞，7天后可见明显的绿色荧光表达，表明重组的腺病毒包装成功，用 PCR及Western blot鉴定表明重组腺病毒含有融合基因，表达的模拟表位，可有效的被MG7－Ag单克隆抗体识别；＊)免疫接种后，疫苗免疫组小鼠血清抗MG7叭g抗体较PBS和空载体对照组显著增高，但疫苗免疫组小鼠脾细胞对靶细胞的杀伤率与对照组无显著差异；（4）肿瘤攻击后，疫苗兔疫组小鼠成瘤体积明显小于对照组，瘤体的HE染色可见淋巴细胞浸润，而对照组瘤体内可见明显的血管形成；（5）异源性激发功强接种方法免疫的小鼠血清抗MG卜Ag抗体较DNA疫苗组和重组腺病毒疫苗单一免疫组著增高，但各组小鼠脾淋巴细胞体外杀伤实验未见显?