第一部分HIF-1α介导的骨髓干细胞高表达VEGF和iNOS对心肌细胞保护的体外研究目的:探讨BMSCs是否通过HIF-1α信号通路诱导VEGF和iNOS的高表达,在低氧环境中保护心肌细胞抵抗凋亡。方法:从GFP转基因小鼠分离培养BMSCs。采用体外BMSCs和心肌细胞低氧共培养(1%O2)或H2O2(200μmol)处理模拟体内心肌梗塞氧应激损伤。以LDH释放、MTT摄取、DNA断裂、膜联蛋白V阳性细胞做为细胞损伤指标。ELISA测定BMSCs总HIF-1α、活性HIF-1α蛋白表达及VEGF的释放。实时定量PCR测定BMSCs中HIF-1α、VEGF和iNOS的基因表达。荧光免疫细胞化学观察HIF-1α蛋白定位。结果:心肌细胞低氧暴露30小时,LDH释放增加,MTT摄取降低,该现象可因与BMSCs的共培养得到纠正;同时低氧或H2O2处理所致的心肌细胞凋亡也随之减少。在低氧条件下BMSCs中总HIF-1α蛋白及其激活型蛋白的表达增加,并易位至细胞核及核周区域,同时伴随VEGF和iNOS的表达增加。HIF-1α蛋白的增加及易位可被HIF-1α抑制剂2-ME2 (5μmol)抑制。而且,VEGF和iNOS的分泌以及BMSCs对心肌细胞的保护作用均可被HIF-1α抑制剂2-ME2或HIF-1α中和抗体(200ng/ml～3200ng/ml)所抑制。另外,外源性给予VEGF(12.5ng/ml～100ng/ml)可复制对心肌细胞的保护作用,并呈剂量依赖性。BMSCs对心肌细胞的保护作用也可被选择性iNOS抑制剂1400W(10mg/L)和非选择性NOS抑制剂L- NAME (200μmol/L)所抑制。不过,未发现NO供体SNAP (300μmol/L)与BMSCs在对心肌细胞的保护作用上有协同作用。结论:BMSCs通过激活HIF-1α信号通路诱导保护性因子VEGF和iNOS的高表达,从而在低氧环境中保护心肌细胞抵抗凋亡。第二部分骨髓干细胞条件培养基改善心肌梗塞大鼠心功能的体内研究目的:以大鼠急性心肌梗塞动物模型为基础,体内移植BMSCs条件培养基,探讨BMSCs改善缺血心肌功能的旁分泌机制。方法:LAD结扎后大鼠随机分为5组,在缺血区周围分5点即刻心肌内分别注射60μl○1生理盐水(NS);○2浓缩培养基对照(cM);○3浓缩BMSCs正常氧培养基(BMSCs-cNM);○4浓缩BMSCs低氧培养基(BMSCs-cHM);○5含1.5×106 BMSCs的生理盐水(BMSCs)。超声心电图观察心功能、三色染色分析心脏梗塞面积、TUNEL染色分析凋亡细胞、免疫组化观察血管形成。结果:与其它各组比较,BMSCs-cHM可有效改善缺血心肌功能,减少心肌梗塞面积,减少凋亡细胞,促进血管形成。结论:BMSCs通过分泌细胞保护性因子抵抗细胞凋亡,减少心肌细胞损失,减少梗塞面积,改善心肌功能。BMSCs通过旁分泌效应间接促进血管发生可能为心肌修复的另一机制。第三部分骨髓动员干细胞改善缺血心肌功能与GATA4的相关性研究目的:探讨经心肌梗塞激活的MPCs是否通过高表达GATA4,从而更有利于参与心肌修复。方法:MPCs分离自经LAD结扎的GFP转基因小鼠心脏血。野生型小鼠经LAD结扎后随机分为三组,心肌内植入MPCs、BMSCs或DMEM做为对照。心脏超声测定心功能,三色染色法检测梗塞面积。FCM分析MPCs和BMSCs细胞表型。常规PCR或实时定量PCR做基因表达分析。ELISA测定血清G-CSF分泌。基因芯片分析转染了GATA4的BMSCs的基因谱。免疫荧光检测细胞的转分化。结果:缺血心肌G-CSF表达增加,血清G-CSF增加与循环血MPCs的增加呈正相关。MPCs与BMSCs细胞表面标记相似,但MPCs高表达GATA4。转染了GATA4的BMSCs的基因谱显示GATA4上调一系列心血管发育相关基因、生长因子及抗凋亡蛋白Bcl-2。MPCs移植明显改善心功能,减少梗塞面积。更为重要的是,体外实验显示相对于BMSCs,MPCs更有效的保护心肌细胞抵抗低氧所致的细胞凋亡,并具有更高的向心肌细胞转分化的能力。MPCs对心肌细胞的保护作用可被GATA4 siRNA转染及Bcl-2中和抗体抑制。相反,转染了GATA4的BMSCs增强了对心肌细胞的保护。结论:MPCs更好的改善缺血心肌功能与高表达GATA4相关。