人体正常组织氧分压为2-9%(14-65 mm Hg),而吸入空气的氧分压为21%(160mm Hg),当外界空气中氧分压降低或机体氧气运输利用受阻引起血液及组织中氧分压低于正常值,不能满足组织器官的氧气需求,则引起组织缺氧。低氧是人及动物等生命体十分常见的一种应激条件,已有大量研究表明低氧可引起心脑血管系统、免疫系统、呼吸系统、消化系统和运动系统等诸多生命机能紊乱,例如高海拔地区低气压及低氧分压引起的急慢性高原病、新生儿缺氧诱发的癫痫、感染引起的低氧血症、局部供血障碍导致的脑梗等,这些常见的疾病均与组织或细胞缺氧密切相关。因此,关于低氧相关疾病的发病机理及干预方法一直是低氧领域研究的热点,对于预防和治疗低氧诱发疾病具有重要意义。本文围绕低氧这一主题展开,探讨了具有潜在低氧保护功能且融合穿膜肽HIV-1 Tat的Tat-NGB酵母体系表达及蛋白低氧保护功能、基于亚硫酸钠微生物低氧模型的建立及低氧保护作用机理以及在低氧环境中极易受到损伤的脑组织在极端营养条件下的自我调节机制。目前,对于低氧损伤保护剂的研究主要集中于具有自由基清除作用的多糖类抗氧化物以及天然提取物等,如褐藻多糖等具有抗氧化性的物质具有一定的细胞损伤修复和保护作用,但由于如脑卒中等疾病发病迅速且有血脑屏障的阻碍,应用于临床的低氧损伤保护类制剂或药物极少。脑红蛋白(Neuroglobin,NGB)自2000年被发现以来受到极高关注,是主要分布在神经系统细胞和视网膜的第三类珠蛋白,与血红蛋白、肌红蛋白、胞红蛋白类似,具有携氧功能。大量关于NGB功能的研究显示低氧条件下神经元中的NGB表达量显著升高,同时NGB具有清除超氧自由基的能力,因此NGB具有潜在的抵御细胞低氧损伤的功能。而通过外源重组NGB提高神经元中NGB含量或可预防和治疗低氧对神经组织的损伤以及脑卒中等低氧相关疾病。因此,本文以NGB作为预防治疗神经细胞缺氧症的潜在药物蛋白,并尝试利用酵母表达系统实现重组蛋白高保真表达(除本研究外目前尚未见报道),同时融合表达HIV-1 Tat穿膜肽标签赋予重组蛋白穿膜功能以期克服血脑屏障的阻碍,并对重组蛋白的神经保护功能进行了验证。在低氧研究过程中,模拟低氧是一个重要的环节,目前常用的低氧培养箱等物理方法具有设备依赖性强、费用昂贵、操作复杂等缺点,而氯化钴、连二亚硫酸钠等化学低氧诱导剂又存在重金属毒性、不稳定遇水放热等不足之处,因此本文通过调研及前期工作参考将亚硫酸钠作为一种低氧诱导剂应用于微生物的低氧培养并初步探讨了大肠杆菌低氧调节的相关机制。大脑在机体缺氧时极易受到损伤,它在人及动物体中都是神经中枢,占有重要的地位,在低氧研究中也是重要的靶器官,对其应激机制研究也至关重要。基于对脑在应激条件下的应答策略和调节机制的关注,本文同时对此进行了相关研究。脑组织重量仅为机体比重的2%却要消耗20%的能量。传统理论认为大脑在能量利用方面具有自私性,自身储能极少,所需能量都是从周围神经组织获取甚至以损伤其他组织器官为代价。脑红蛋白的发现进一步佐证了这一观点,因其具有高效的携氧能力可保证脑组织的供能供养。而本文中从脑组织营养极端缺乏条件下水分调节及自噬角度进一步对脑在机体中的特殊地位进行了探讨。本文的主要研究成果及结论如下:1.重组脑红蛋白真核表达纯化及其对低氧损伤保护效应研究利用此前构建的人源脑红蛋白原核表达载体p ET28b-Ngb作为模板通过PCR扩增获取目的基因片段。Ngb目的基因与p PIC8k载体经Eco RI、Not I双酶切并连接后完成含Ngb基因的p PIC8k-Ngb载体构建。分别用SalⅠ、BglⅡ两种酶将载体线性化后电转化到宿主毕赤酵母菌GS115细胞后涂板利用MD培养板筛选阳性克隆,经SalⅠ、BglⅡ两种酶线性化的质粒均实现转化长出阳性克隆。随后经MM、MD培养板筛选出甲醇营养型的菌株,继而通过遗传霉素G418和菌落PCR筛选具有外源质粒高拷贝数的菌株、诱导表达并SDS-PAGE检测从中选出可高表达重组NGB蛋白的菌株用于后续蛋白纯化及功能研究。上述Ngb基因真核表达载体的构建及高产目的菌株的筛选过程,成功地实现了重组NGB蛋白在酵母表达体系中的表达。外源重组蛋白经真核细胞加工修饰更加保真了其原有功能,另外重组NGB蛋白可直接分泌到毕赤酵母培养液中简化了收集蛋白的复杂性,也避免了包涵形式无效蛋白的表达,为后续重组NGB的功能研究及应用研究奠定了基础。利用上述筛选出的高效表达NGB重组蛋白的酵母菌株采用Ni-NTA亲和层析柱将酵母表达上清液中的重组NGB蛋白富集纯化。纯化后的含Tat标签的Tat-NGB及不含Tat标签的NGB蛋白分别与PC12细胞共培养12 h后通过Western blot检测细胞内的NGB蛋白含量,结果发现His-NGB-His共培养细胞中未见重组NGB蛋白,而Tat-NGB-His组细胞中可检测到明显的重组NGB条带,说明HIV-1 Tat跨膜转导肽标签的融合表达使重组NGB蛋白具有穿膜功能。细胞中重组NGB蛋白在1.5 h内即可累积到稳定水平,进入细胞的速度可以满足低氧细胞干预治疗的时间窗。利用CCK-8试剂盒检测低氧环境培养细胞分别加入终浓度为5 m M Tat-NGB、NGB后细胞活性,结果显示低氧明显抑制了对照组和NGB组的细胞活性,而Tat-NGB组表现出显著提高的细胞活力。说明重组Tat-NGB不仅能穿膜进入神经细胞并且可以在细胞内发挥低氧损伤修复保护等作用。综上所述,本部分研究首次实现了重组NGB蛋白在毕赤酵母真核表达体系中的表达纯化。得到的重组NGB蛋白不仅保真了NGB蛋白原有的功能可有效的保护PC12细胞在低氧条件下的生长,而且还经由HIV-1 Tat标签实现了跨膜转导功能,为重组NGB作为神经保护药物的潜在应用奠定了前期实践基础。2.亚硫酸钠在微生物低氧诱导中的作用及相关机制研究首先利用微生物生长曲线仪检测不同浓度亚硫酸钠对不同大肠杆菌株系(BL21(DE3)、HB101、DH5α、OP50)发现,亚硫酸钠对大肠杆菌具有明显且广泛的生长抑制作用。继而测定E.coli生长过程中不同时间点的溶解氧含量确认亚硫酸钠对E.coli的生长抑制是由溶氧含量引起的,当Na2SO3浓度大于40 m M时培养体系的无氧状态可稳定维持长达8 h。通过透射电镜(TEM)观察Na2SO3抑制生长的E.coli菌体细胞形态,并未见明显的细胞破裂或损伤。综上所述Na2SO3可耗尽液体培养体系中的氧气快速达到与物理低氧相似的效果、无氧效果稳定且时间足够长、对菌体细胞无明显损伤、使用范围广,由此说明Na2SO3可以作为一种理想的低氧诱导剂应用于微生物厌氧培养及低氧研究。基于Na2SO3低氧模型,通过对低氧相关基因缺失的菌株检测发现,低氧相关通路基因在低氧应答及调节中所起的作用不同,其中fnr、arc B两个基因起到主要作用。考虑到动物肠道中细菌99%为厌氧菌,对Na2SO3的低氧效应研究进一步拓展到动物体内,通过灌胃的方式使Na2SO3溶液进入小鼠胃肠道,从而对亚硫酸钠在动物体内的作用效应进行了探讨,主要从机体整体氧化应激水平角度进行研究。研究结果显示,体内亚硫酸钠并未对动物的生长发育产生明显影响,但其引起小鼠体内脂质过氧化物MDA含量显著升高,同时SOD酶活性也相应增加。说明Na2SO3虽然其对小鼠整体的生长发育没有明显影响,但可通过氧化应激反应对小鼠细胞造成慢性损伤,对动物而言较高浓度Na2SO3溶液不适合用于其体内研究。然而对于动物肠道内的丰富菌群来说,其中99%为厌氧菌,依赖于肠道的低氧或无氧环境生存,Na2SO3消耗掉肠残余氧气或许有利于肠道菌群的生长及其有益生理作用的发挥,这一研究思路将成为后续研究的重点。在调研可用于低氧诱导的化学试剂时,考虑到最常用的Co Cl2具有严重的重金属毒性,后续的研究比较了钴等重金属离子对E.coli生长繁殖的抑制作用。研究发现重金属离子对E.coli的生长具有明显的损伤效应,但不同重金属离子的作用方式存在差异。3.小鼠脑组织在极度营养缺乏条件下自我调节及机理研究将小鼠分为禁食组、禁水组和水食双禁组,各组小鼠体重和血糖均随时间急剧下降,然而脑的重量却能相对保持稳定,且对脑组织进行HE染色观察显示那组织细胞形态正常并未出现明显的损伤,因此在禁食禁水这种极端营养条件下,脑组织可以实现自我保护维持其生理形态和功能。进一步通过RT-PCR的方法分析脑组织的水通道蛋白AQP-1、AQP-4的表达可见两基因的表达可基本维持正常水平以保证脑组织的正常而稳定的水含量。用Western Blot方法检测LC3蛋白表达以确定各组脑组织自噬水平高低,结果显示各实验组脑组织的自噬水平均有不同程度的提高,而水食双禁组表现的最为明显。综上本章内容研究了小鼠在饮食饮水限制的极端营养条件下脑组织自我保全的现象。并从含水量维持及平衡相关蛋白AQPs表达量角度解析了脑组织自我保全过程中水分平衡的机理。自噬蛋白的分析解释了脑组织在极端恶劣情况下除了与周边器官竞争能量的自私行为之外,也有通过自噬基于自身蛋白分解的自我拯救行为。亦即从含水量角度拓展了自私大脑的理论,并从自噬的非自私角度对自私大脑理论进行了补充。另外,在后续的研究中,AQP蛋白家族在营养不良等环境条件下对组织水含量的调控值得深入挖掘,可能为营养不良及相关症状的预防和治疗提供潜在的干预靶位和药物靶点,为低氧脑损伤研究也提供了相关的切入点。