骨缺损是临床治疗过程中常见的疾病,小的骨缺损可以通过骨组织的自身再生进行修复,但当骨缺损超过骨再生能力时,常致骨不愈合,严重影响相应肢体功能。所以较大的骨缺损常常是临床上治疗的难点。骨缺损传统的治疗方法有自体骨移植、同种异体骨移植等,但由于其来源有限及免疫反应等问题而无法广泛用于骨缺损尤其是大范围的骨缺损。骨组织工程的方法为骨缺损的治疗提供了新的思路及方法,利用骨组织工程所构建的骨组织治疗骨缺损是目前研究的热点。目前骨组织工程的研究主要集中于生物支架材料、种子细胞及因子的研究。层层组装的三维支架构建技术是将生物材料层层叠加组装,将现有的二维平面结构构建成有助于细胞生长的三维结构的方法。层层组装的方法可以构建与机体内环境相似的三维结构,从而增加细胞与支架,细胞与细胞之间的联系。该结构能够为细胞生长提供化学浓度梯度,为细胞生长提供其必需的物质及空间。同时通过改变每层膜结构,更换种植的细胞,层层组装技术可以将纳米纤维膜构建成具有多种功能的三维支架。静电纺丝技术是利用高压电场作用下使聚合物形成稳定的纳米纤维而构建支架的技术,其近年来迅速发展并应用于组织工程,由于其产生的纤维直径小,大部分为纳米级别,远小于细胞直径大小,而且该类纳米级别的纤维与细胞外基质结构相似,所以目前静电纺丝材料常用于构建细胞外基质或组织工程支架。聚已内酯(PCL)具有良好的机械性能,且具有良好的生物相容性。明胶(gelatin)具有良好的生物相容性及细胞粘附性。两者相结合可以使构建的结构具有一定的机械性能并能具有良好的细胞粘附效果,使其更有利于组织工程支架的构建。脂肪间充质干细胞(ADSCs)是目前种子细胞研究的热点,该间充质干细胞具有较强的自我更新及增殖分化能力,是具有向多个方向分化潜能的多能干细胞,在一定条件下,其能增殖分化为脂肪细胞、成骨细胞、成纤维细胞、神经细胞、血管内皮细胞等。同时由于其具有来源丰富、取材操作简单、培养方便以及不涉及伦理道德问题等优点,ADSCs是目前应用最有前景的干细胞。本研究以PCL及gelatin为原料,利用静电纺丝技术构建了静电纺丝纳米纤维膜,所得到的静电纺丝膜具有孔隙率大、纤维均匀、纤维直径小至纳米级、具有较好的机械性能及生物相容性等特点。我们将ADSCs种植于PCL/gelatin静电纺丝纳米纤维膜(nanofibrous membrane, NFM)上,检测了该NFM的细胞相容性及细胞在NFM上生长的增殖情况,结果显示该NFM具有很好的生物相容性,细胞在膜上粘附好,能正常生长增殖。应用ADSCs载荷的NFM进行层层组装构建了ADSCs载荷的NFM层层组装三维支架结构,并检测该支架结构内ADSCs存活情况,细胞Live/Dea d染色结果示,该支架内的ADSCs能大部分成活,细胞增殖试验结果显示ADSCs在NFM层层组装三维支架结构内能显著增殖,开始12小时内其与对照组相比低少许,但培养24小时后其增殖明显高于对照组。将该ADSCs载荷的NFM层层组装三维支架进行培养,检测该支架内ADSCs的成骨相关基因表达情况,结果显示成骨诱导培养的ADSCs载荷的NFM层层组装三维支架结构组具有最好的成骨分化效果,成骨相关基因表达量较其他组高。将ADSCs载荷的NFM层层组装三维支架结构种植于大鼠颅骨缺损处以检测该支架结构修复颅骨缺损的效果,大体标本、micro-CT结果及组织切片结果均显示ADSCs载荷的NFM层层组装三维支架结构具有很好的成骨及修复骨缺损的能力。第1章大鼠腹股沟皮下脂肪来源的脂肪间充质干细胞的鉴定及成骨效果研究目的：对大鼠腹股沟皮下脂肪来源的ADSCs进行鉴定,明确所获得的ADSCs的纯度,并对ADSCs进行成骨诱导培养,明确大鼠腹股沟部脂肪来源的ADSCs的成骨效果。方法：3只2个月大小,平均体重为227g±14.8g的SD大鼠(购于南方医科大学实验动物中心),经腹腔注射麻醉后,常规手术操作切取大鼠腹股沟皮下脂肪组织。对脂肪组织进行剪切、消化、提取ADSCs进行原代培养。所得ADSCs进行以下检测： (1)显微镜下细胞的形态学观察； (2)第4代的ADSCs应用流式细胞术检测CD29、CD90、CD49d、CD45、CDllb及CD106各表面标志物,对ADSCs进行鉴定,并确定其纯度； (3)对所获得的ADSCs进行成骨诱导培养,应用碱性磷酸酶(ALP)染色及Alizarin red (茜素红)染色检测其成骨分化能力。结果： (1)显微镜下ADSCs大小约50-100 μm,细胞较大,核大居中,胞浆丰富,细胞呈多角形,细胞长长融合后呈梭形漩涡状排列。 (2)ADSCs的流式细胞术检测：特征性表面抗体阳性率为CD29 (99.65%), CD90 (68.38%)及CD49d (86.82%), ADSCs非特征性抗体的阳性率：CD45(0.06%),CD11b (0.24%) 及 CD106 (0.84%). (3)ALP染色结果示：成骨诱导后的ADSCs染成灰色,结果阳性。茜素红染色结果显示：ADSCs大范围红染,视野内可见多量呈红色深染的矿化结节,结节散在分布,中心部颜色较深。结论： (1)AADSCs来源丰富、容易获得、取材简单,易于培养,无需特殊培养条件,这均为其应用提供了有利条件； (2)我们提取的大鼠腹股沟皮下ADSCs的形态及表型符合间充质干细胞的特征； (3)我们所提取的大鼠腹股沟皮下AADSCs纯度较高,可应用于组织工程的研究； (4)大鼠腹股沟皮下ADSCs具有良好的成骨分化功能。第2章静电纺丝纳米纤维膜支架的构建、生物特性检测及其体外促进ADSCs成骨分化的效果目的：本研究应用静电纺丝技术构建静电纺丝纳米纤维膜,检测其生物相容性及细胞在膜上的增殖及成骨分化情况,应用纳米纤维膜层层组装构建三维支架,检测ADSCs在该三维支架内的成骨效果。方法：本研究以PCL及gelatin为材料,分别以10%浓度溶于三氟乙醇溶剂,然后将两溶液以1：1比例混合,利用静电纺丝技术构建纳米纤维膜(nanofiber membrane, NFM)。(1)对该纳米纤维膜的形态学进行观察及检测；(2)将ADSCs种植于NFM上,观察NFM的生物相容性,并检测ADSCs在NFM层层组装的三维支架上的增殖情况,采用析因设计资料的方差分析方法进行统计分析及应用两独立样本的t检验比较两组4个时间点增殖的差异； (3)应用扫描电镜观察NFM的纤维结构,并测量其纤维直径大小,扫描电镜下观察细胞在NFM上的生长情况； (4)应用Live/Dead染色技术以检测ADSCs在NFM三维支架内的存活情况； (5)将AADSCs载荷的NFM膜在体外进行成骨诱导,进行成骨相关蛋白的荧光染色,检测成骨相关蛋白即骨钙蛋白(osteocalcin, OCN)、骨桥蛋白(osteopotin, OPN)与骨保护素(osteoprotegerin, OPG)的表达情况； (6)将ADSCs载荷的NFM膜进层层组装,然后按(5)所示的方法进行体外成骨诱导,检测ADSCs载荷的NFM层层组装的三维支架各成骨相关基因(OCN、OPN、OPG、BSP、RUNX2及OSX)的表达情况,应用单因素方差分析及独立样本的t检验等统计方法对各组进行比较,单样本与对照组比较时采用单样本t检验,P<0.05认为差异有统计学意义。评价该层层组装三维支架结构对成骨的影响。如无特殊说明,每次实验进行3次生物学重复,每个样品至少重复测量3次。结果： (1)形态学观察：NFM厚度约为50μm,具有一定的机械性能；(2)扫描电镜下观察可见NFM纤维直径总体均匀,少部分纤维直径相差悬殊,纤维直径大约是500-1500nm,纳米纤维相互交错,呈不同立体结构,纤维间有大小约10-50-tm左右的孔隙,孔隙间相通。NFM上可见ADSCs生长,细胞伸展,呈多角形,细胞与纤维之间联系紧密,有些两者融合,细胞胞体能部分长入纳米纤维膜的孔隙内。(3)ADSCs能在NFM上快速增殖,于24小时时间点后显著高于对照组(t48h=-7.723,P48h=0.002；t72h=-14.912,P72h<0.001,F分 组=1451.881,P分组<0.00.,F时间=69.878,P时间<0.001。交互效应：F=48.482,P<0.001) (4)ADSCs种植于NFM上后,2周及4周时间点时,对样本进行免疫荧光染色,2周时结果显示细胞外基质内OCN.OPN.OPG蛋白均有显色,示有相应蛋白的分泌,但表达量较低,4周时以上各蛋白表达量均明显高于2周时的蛋白分泌量； (5)将ADSCs载荷的NFM进行层层组装(3层)并进行成骨诱导培养,于1、2、3及4周四个时间点分别检测各组基因表达情况,结果示3周及4周时间点时,AADSCs-NFM成骨诱导培养基组的基因表达OCN(F3w=54.049, P3w<0.001；E4w=60.811,P4w<0.001).OPN(F3w=47.975,P3w<0.001；F4w=67.588, P4w<0.001).OPG(F3w=28.306,P3w=0.001；F4w=151.551,P4w=0.001,). BSP(F3w=84.607,P3w<0.001；F4w=216.219,P4w<0.001).RUNX2(F3w=10.950, P3w=0.003；F4w=4655.158,P4w<0.001)及OSX(F3w=2314.216,P3w<0.001; E4w=1405.869,P4w<0.001)显著高于其余各组,差异有统计学意义。结论： (1)PCL及gelatin所构建的NFM生相容性好,细胞能够很好的贴附于支架上,细胞在NFM上生长良好； (2)PCL及gelatin所构建的NFM有较大的孔隙率,此结构有助于营养扩散及产物排出；其纤维结构与细胞外基质相似,可用作为细胞外基质,促进细胞生长； (3)ADSCs能在NFM上生长良好,在诱导情况下能表达成骨相关蛋白(OCN,OPN及OPG); (4)ADSCs载荷NFM构建的三维支架结构能促进ADSCs向成骨细胞分化并促进表达相应成骨基因表达,促进成骨发生。第3章ADSCs载荷的NFM层层组装构建的3维支架修复大鼠颅骨缺损目的：本研究将ADSCs载荷的NFM层层组装构建的3维支架应用于修复大鼠颅骨缺损,明确其在大鼠体内的成骨效果。方法： (1)按第二部分所述的方法,将ADSCs种植于NFM上进行层层组装构建ADSCs载荷的NFM层层组装3维支架； (2)将以上3维支架种植于大鼠颅骨缺损部位,术后12周取材,并对大体标本进行观察； (3)应用micro-CT方法对以上所有样本进行扫描,明确所有样品再生骨组织的骨矿物质密度,对样品进行三维重建明确骨修复的情况； (4)应用HE染色及Masson染色比较各组样品骨修复情况的差异； (5)各组样品进行RT-qPCR检测,采用独立样本t检验的统计学方法进行对比,明确各组在各成骨相关基面表达上的差异。结果： (1)各组样品大体结果示：ADSCs载荷的NFM层层组装修复组的颅骨缺损样品表面平整,已无缺损残留,其对颅骨缺损的修复效果最好。(2) micro-CT检查结果示ADSCs载荷的NFM层层组装修复组的再生骨组织的矿物质密度为823.047±47.010mg/cm3,较其他两组再生骨组织的矿物质密度高(缺损组的BMD 58.348±4.435,NFM组的BMD为610.666±51.733,ADSC-NFM组的BMD为823.047±47.010,三者比较F=857.565,P<0.001,差异较有显著统计学意义)。三维重建结果示该组的原颅骨缺损区域已大部分修复,且修复组织无显著台阶感。(3)HE染色及Masso n染色结果均示ADSCs载荷的NFM层层组装修复组生成的骨组织最多,结构与正常骨相似,其修复效果最好。 (4)各组样品进行RT-qPCR检测,各成骨相关基因表达示ADSCs载荷的NFM层层组装修复组的成骨基因表达均高于颅骨缺损组OCN(t=13.355,P=0.006)、OPN (t=22.535, P=0.002)、OPG(t=22.67, P=0.002);BSP (r=24.268,PBSP=0.002)、RUNX2(t=8.510,P=0.014)、OSX (t=12.722,P=0.006)及层层组装的NFM修复组即NFM组的OCN(t-7.815,P=0.001)、OPN (t=-10.288,P=0.002)、OPG (t-5.528,P=0.05)、BSP (t=-22.721, P<0.001)、RUNX2 (t=-7.053,P=0.001)及OSX (t=-9.441,P=0.001)。结论： (1)ADSCs可以在NFM层层组装3D支架上分化促时成骨相关基因蛋白的表达,促进骨的形成； (2)ADSCs载荷的NFM层层组装的三维支架材料可以用于骨组织工程中骨缺损的修复： (3)NFM层层组装3D支架有助于ADSCs向成骨细胞分化。