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α-葡聚糖酶是一种重要的工业用酶,主要用在制糖工艺中,针对性地分解其中出现的α-葡聚糖,以优化糖厂制糖工艺,降低制糖成本,提高糖产品质量。目前国内对α-葡聚糖酶的研究还处于初级阶段,天然菌株产酶量及酶性能都满足不了实际应用。随着基因工程方法的广泛应用,为实现α-葡聚糖酶的基因工程菌表达提供了可能。本研究的内容即是采用一株重组毕赤酵母生产α-葡聚糖酶,对发酵过程进行优化,并对其理化性质进行分析,主要研究内容及相应结果如下:
试验在摇瓶水平对重组毕赤酵母表达α-葡聚糖酶的诱导条件进行了研究,得到的结果为:培养基以有机培养基BMMY为宜;离心与否对α-葡聚糖酶的表达影响不大;添加0.01%的油酸和0.2%Tween-80、pH值6.0、装液量为25mL,/250mL、摇床转速为200r/min、种龄为24h、接种量为10%、温度为30℃、甲醇诱导浓度为1.5%、每12h补加一次甲醇、诱导144h,α-葡聚糖酶表达量最高,为73U/mL。且提高甲醇浓度稳定性更有利于表达α-葡聚糖酶,在发酵罐培养流加成分中可以此作为参考。
利用5L发酵罐进行重组毕赤酵母发酵优化,主要考察诱导菌体浓度、溶氧、甲醇残留、酪蛋白水解物等主要因素。发酵罐优化得到的最优发酵条件为:菌体湿重250g/L(诱导菌体密度)才开始诱导,诱导表达阶段溶氧控制在10-20%,最优诱导时间为90h,另外添加1%的酪蛋白水解物(外营养物),有利于α-葡聚糖酶的表达和稳定,在此最佳条件下发酵得出的结果为330U/mL。
同时还确定了α-葡聚糖酶粗酶液的酶学性质,该酶的最适反应温度为50~C,在30℃以下长时间放置酶活力均能保持90%以上,在40℃以上放置24h就完全失活,最适反应pH为5.0,在pH为4-6的较窄范围内较稳定,小于4或大于6酶都比较易失活,Fe3+、Mg2+和Co2+对该酶有激活作用,Ca2+、K+、Zn2+、Na+、Al3+的作用不是很明显,Cu2+、Ba2+、Fe2+、Sn2+、Ag+对酶有抑制作用。