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禽大肠杆菌病是由大肠杆菌某些血清型引起的一类疾病总称,国内随着集约化养禽业的发展,大肠杆菌病呈显著上升趋势,成为养禽业中重要的细菌性疾病之一。为检测安徽省禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli, APEC)中耶尔森菌强毒力岛(high pathogenicity island, HPI)的携带情况,探明禽大肠杆菌病与耶尔森菌强毒力岛之间的关系,本实验首先从临床上分离到8株禽致病性大肠杆菌,根据Genbank中发表的小肠结肠炎耶尔森菌强毒力岛所有毒力基因序列的保守区,设计并合成12对特异性引物,检测APEC安徽分离株的HPI基因携带情况,并且初步探讨了分离株致病性与HPI之间的关系。1安徽部分地区禽致病性大肠杆菌的分离与鉴定病料来源为安徽省各地区具有典型大肠杆菌病病变的病死鸡或发病鸡,无菌操作取病料直接划线于普通营养琼脂上,经麦康凯鉴别培养基分离得纯培养物,通过染色镜检观察菌体形态及染色特性,将30份分离纯培养物进行10项生化指标的测定,鉴定得到符合大肠杆菌特征的菌株有12株。每个分离菌株分别以0.2mL/只的剂量腹腔接种2日龄雏鸡10羽。结果显示,接种后12-72h攻毒组雏鸡表现精神沉郁、呼吸困难、喘气、垂翅、竖毛、饮食欲下降或废绝,之后各组鸡都有不同程度的死亡,随时剖检死亡雏鸡发现主要病变为气囊混浊、心包积液、肝脏肿大并且淤血。对照组雏鸡全部健全,无明显症状,剖杀后未发现明显病变。鉴定出致病性大肠杆菌8株,根据Rosenberger的方法进行菌株毒力判定,确定高致病性菌株为3株、中度致病性菌株为5株,并且参考株经鉴定为高致病株。2安徽部分地区禽致病性大肠杆菌HPI全岛基因的检测按照细菌基因组DNA小剂量试剂盒说明书提取细菌基因组DNA,参照Genbank登录的小肠结肠炎耶尔森菌WA (O:8) HPI irp9、irp8、irp7、irp6、ybtA、irp2、irp1、irp3、irp4、irp5和fyuA和AsnT-tRNA-intB的基因序列(登录号分别为AJ13268、AJ13268、AJ13268、AJ13268、AJ13268、L18881、Y12527、Y12527、Y12527、Y12527、Z35486、AJ13268),设计并合成12对特异性引物。应用所建立的PCR方法检测了8株APEC安徽分离株,E.coli (CVCC1565)为阳性对照菌株,检测安徽省部分地区APEC分离株HPI的携带情况,结果阳性对照菌株和8株临床分离菌株中HPI基因的检出率均为100%,而非致病大肠杆菌未检测到HPI基因；对扩增的的12种基因片段进行核苷酸序列测定,与GeneBank中公布的基因进行Blast同源性分析,所得的片段与预计的基本一致,且同源性达到95%以上。结果显示：APEC分离株检测到HPI阳性,非致病大肠杆菌未检测到HPI阳性,可以得出结论,APEC菌株的致病性与HPI的携带可能存在一定的关系。3安徽部分地区禽致病性大肠杆菌分离株LD50的测定将高致病株E.coli (X0904EC22)、中致病株E.coli (X0904EC13)、高致病参考株E.coli (CVCC1565)及非致病株E.coli (X090405EC)分别配置成104、105、106、107、108cfu/mL5个剂量组,每组5只鸡按0.2mL/只的剂量进行腹腔注射,参考株作为阳性对照,灭菌生理盐水为阴性对照组,连续观察14d。结果显示,在实验期间E.coli (X0904EC13)、E.coli (X0904EC22)、E.coli(CVCC1565)攻毒鸡只表现典型的大肠杆菌病病状并有不同程度的死亡,非致病株E.coli (X090405EC)并没有出现病状和死亡；随时剖检死亡雏鸡并取病变组织于10%福尔马林溶液中保存。详细记录各组雏鸡死亡数,死亡率及存活率,按照Reed-Muench法计算得出,E.coli (X0904EC13)、E.coli (X0904EC22)、E.coli (CVCC1565)的LD50分别为106.7 cfu/mL、105.9 cfu/mL、104.7 cfu/mL。由上述实验可以得出：非致病大肠杆菌没有携带HPI,在攻毒中未出现死亡,而E.coli (X0904EC13)、E.coli (X0904EC22)、E.coli (CVCC1565)检测均携带HPI基因且在攻毒过程中都有不同程度的死亡,所以说大肠杆菌的致病性在一定程度上可能取决于是否存在HPI；但是,E.coli (X0904EC13)、E.coli (X0904EC22)、E.coli (CVCC1565)都携带HPI且同源性达到95%以上,不同的菌株毒力上却存在差异,这种现象提示致病性大肠杆菌毒力不仅仅取决于HPI。4人工攻毒APEC分离株雏鸡的病理形态学变化分别将固定在10%的福尔马林溶液中的死亡雏鸡组织,经过冲洗、梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋、组织切片、H-E染色等步骤,对处理好的切片进行拍照,结果E.coli (X0904EC13)、E.coli (X0904EC22)、E.coli (CVCC1565)攻毒组的心脏,肝脏、回肠可以检测到典型的大肠杆菌病病变：心外膜增厚,肝脏淤血,肝细胞发生脂肪变性,肠绒毛脱离等,而非致病株未能观察到明显病变。以上研究表明,本研究成功的从临床上分离鉴定出APEC8株,从APEC分离菌株及标准参考株中检测出HPI全岛基因,并初步探讨了HPI携带与大肠杆菌致病性存在的关系。本论文的研究为从基因水平进一步揭示禽大肠杆菌病的致病机理提供了一定的研究基础。