花粉发育是植物有性生殖的重要一环,花粉壁的正常发育对于花粉形态和功能的维持尤为重要。花粉内壁主要由果胶等组成,果胶的合成和修饰过程若有异常,则会直接影响内壁的发育,进而造成花粉萌发及花粉管生长等异常。果胶甲酯酶(pectinmethylesterase,PME)是果胶侧链的一种重要修饰酶,已有研究表明,在拟南芥和白菜中,有数个PME基因参与花粉内壁的形成。拟南芥中至少有15个PME参与花粉发育,白菜中也有20多个PME与花粉发育相关,但其中绝大部分PME基因的具体功能还不清楚。研究白菜基因功能的传统方法主要有诱变、反义干涉、RNA干涉、过表达等,但由于白菜在进化过程中经历了一次全基因组三倍化事件,导致其基因组内同源基因比较多,上述方法在实际应用过程中存在很多局限。新兴的CRISPR/Cas9基因编辑技术可以很好地解决这些问题,但白菜中尚未建立起成熟的CRISPR/Cas9体系。本文首先通过生物信息学的方法对白菜等九种植物的PME基因家族成员进行鉴定,再结合网上公布的转录组数据对这些PME基因进行表达分析;然后找出各个植物中花发育特异或优势表达的PME,对其进行序列比对和启动子顺式作用元件预测;继而以白菜(Brassica campestris L.subsp.chinensis Makino,syn.B.rapa subsp.chinensis)’矮脚黄’核不育(’Aijiaohuang’genic male sterility,ajhGMS)两用系’Bcajh97-01A/B’为材料,采用qRT-PCR技术进一步确认白菜PME家族成员的表达,特别是 BcPME37a(BraA09g051660.3C)、BcPME37b(BraA04g000830.3C)和 B)和BcPME37c(BraA07g025040.3C)三个基因在可育系花发育中的表达特点;随后,以’油青四九’菜心(B.campestris subsp.chinensis var.parachinensis cv.Youqing 49)为材料,采用 CRISPR/Cas9技术对三个PME基因进行基因编辑,再综合运用进行形态学、分子生物学、细胞学等方法分析BcPME37c在白菜花粉发育中的功能。取得的主要结果与结论如下:(1)在白菜等九种植物中共鉴定到了709个PME基因,每种植物的PME家族成员数量都很多。对PME家族成员进行表达分析,发现有相当大一部分PME基因参与花粉的发育。MEME程序分析结果表明这些花发育相关的PME在蛋白序列上有较多保守基序。进一步用PlantCARE工具分析其启动子,结果表明这些PME也有很多相同的顺式作用元件。这些结果说明花粉发育相关PME在不同的植物中极其保守。(2)根据白菜基因组数据库的参考序列设计引物,在’油青四九’菜心中克隆得到了BcPME37a、BcPME37b和BcPME37c的DNA序列和CDS。比对结果表明这三个基因相似度很高,且与拟南芥PME37(At3g62170)有很高的相似性。进一步通过qRT-PCR分析发现BcPME37a、BcPME37b和BcPME37c均在成熟花粉时期表达水平较高。授粉后数小时的雌蕊中,BcPME37a和BcPME37b仍有较高的表达,但是BcPME37c却几乎没有表达。启动子融合GUS转化拟南芥的实验进一步证实了BcPME37c在成熟花粉时期的花药中表达量最高。BcPME37a、BcPME37b和BcPME37c是拟南芥PME37在白菜中的同源基因,但它们三个的表达特点不尽相同,表明它们可能有功能分化。(3)对拟南芥CRISPR/Cas9载体进行改造,针对BcPME37a、BcPME37b和BcPME37c设计了三条sgRNA,并成功构建了 pBI121骨架的CRISPR/Cas9载体。对’油青四九’菜心的遗传转化得到了多个基因编辑的芽系,编辑效率可达到50%。不仅实现了BcPME37c单靶点的基因编辑,还实现了BcPME37b和BcPME37c两个靶点的同时编辑。对预测的潜在脱靶位点进行测序,发现基因编辑芽系中没有发生脱靶。bcpme37c自交留种,后代中检测到了不含T-DNA片段的植株。(4)对bcpme37c观察发现,相比于对照植株,突变体的营养生长过程并无明显差异,花器官发育正常,结籽率没有变化。进一步对花粉进行亚历山大染色,发现BcPME37c的敲除突变体的花粉吸胀后有约5%的花粉直径明显增大。扫描电镜观察结果显示突变体约5%的花粉畸形,畸形的比例与吸胀后直径增大的花粉的比例相当。透射电镜观察结果表明,突变体在双核花粉期和三核花粉期花粉内壁异常加厚。BcPME37c被敲除之后,花粉内壁中同聚半乳糖醛酸(Homogalacturonan,HG)的甲酯化程度很可能异常升高,同时花粉特异表达的其他PME可能上调表达,最终导致花粉内壁异常加厚,进而影响花粉的吸胀和花粉的形态。