疟疾(malaria)是由顶复亚门疟原虫(plasmodium)感染造成的,是一种经血液传播的劣性传染性疾病,与结核、艾滋病共同被世界卫生组织认定为世界传染性疾病。尽管全球公共卫生条件不断地改善,但目前全世界每年依然有数亿疟疾感染病例和数十万死亡病例。因此,认识疟原虫,消除疟疾是一个迫切需要解决的重大课题。迄今为止,CRISPR/Cas9是疟原虫基因功能研究中最为高效的修饰工具。但由于疟原虫有限的耐药筛选标记,使得研究者需要将所有的修饰元件整合到一个载体上,这就造成了载体容量过大;加之疟原虫红细胞胞内寄生的属性,电击转染的载体需要依次穿过四层膜结构才能到达疟原虫的细胞核;载体容量过大和复杂的膜结构均限制了电击转染的效率。为了平衡载体大小和电击转染效率的关系,我们将修饰元件中长约4.5kb的Sp.Cas9进行了内源基因座位的整合,从而将载体大小缩减为原来的一半;同时我们发现内源整合表达Sp.Cas9的虫株可以实现Cas9的转录、翻译及蛋白的细胞核定位;此外表达Sp.Cas9细胞的阳性率接近100%,显著高于质粒瞬时转染的效率(约50%)。为了验证该虫株进行基因修饰的可行性,我们分别选择了两个对疟原虫动合子运动必须的基因cdpk3和ctrp进行基因敲除测试,同时选择了两个已知PV膜定位的sepl和动合子类晶体定位的dhhc10进行短肽标签的基因敲入测试;结果显示,内源整合表达的Sp.Cas9可以实现不同类型的基因修饰,同时获得的较小的载体(pYCs)不仅解决了载体过大导致的转染效率低下的问题,同时提高了分子克隆的效率。与传统方法相比,稳定表达Sp.Cas9蛋白的虫株具有更灵活、高效的基因编辑潜能,为约氏疟原虫全基因组水平敲除筛选提供了可能。