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杂种优势是生物界的一种普遍现象,也是提高动植物生产水平的重要途径之一。但是由于杂种优势遗传基础的复杂性以及研究方法与手段的局限,杂种优势表现的遗传机理及有效的预测方法还没有获得突破性的进展。这一状况限制了杂种优势的进一步利用。近多年来,随着分子生物学的发展,各国学者都从分子水平上对杂种优势的机理和预测问题进行了广泛而深入的研究。 本研究以梅山猪、大白猪及其正反交F1代为实验材料,结合生产性状资料分析了亲子代间DNA甲基化差异,探讨了DNA甲基化与杂种表现的关系。并且,以随机扩增多态性技术(RAPD)分析了6个中外猪种的遗传多样性,获得的主要结果如下: 1.普遍认为DNA甲基化与基因表达调控有关。为探讨DNA甲基化与杂种表现的关系,进而为研究其与杂种优势的关系奠定基础,本研究在实验室建立了甲基化敏感扩增多态性(MSAP)和甲基化敏感随机引物PCR(MS-AP-PCR)两种技术平台。 2.以MSAP方法检测了猪基因组中1508个CCGG位点。结果梅山猪10.3%的CCGG序列处于甲基化状态,其中81%处于半甲基化状态,19%处于内甲基化状态;大白猪基因组10.5%的CCGG序列处于甲基化状态,其中79.2%为半甲基化,19.8%为内甲基化:大梅F1代基因组有10.2%的CCGG甲基化,其中半甲基化占80.7%,内甲基化占19.3%;梅大F1代基因组也有10.2%的CCGG序列甲基化,但半甲基化为82.5%,内甲基化为17.5%。整体上,亲子代间及正反交F1间甲基化差异不显著。 3.但是,亲子代特定位点甲基化存在以下的差异类型:(1)双亲与F1代相同甲基化,这类占总甲基化位点的20.4%;(2)单亲与F1代相同甲基化,这类占总甲基化位点的26.5%;(3)F1代甲基化增强,这类占总甲基化位点的33.4%:(4)F1代甲基化减弱,这类差异占总甲基化位点的19.7%。此外,在本研究中还发现了正反交特定位点甲基化的差异,称之为正反交F1代特异甲基化。 4.进一步分析了双亲与F1代相同甲基化、单亲与F1代相同甲基化和F1甲基化减弱差异类型与杂种表现的关系,结果表明:特殊甲基化位点中,三种甲基化差异类型均与杂种一代表现显著相关。 5.分析了多态性甲基化位点对杂种一代表现的效应。不同的位点表现并不一致,有的位点甲基化增强或减弱对杂种表现有利,有的却不利。而且,同一位点甲基化的改变对不同性状的作用方向也不同。 6.分别从一般甲基化位点、中性甲基化位点和特殊甲基化位点角度,分析了杂华中农业大学博士学位论文种一代个体间的甲基化百分差异对生产性状的影响。结果,个体一般和中性甲基化百分差异对很少生产性状产生显著影响或无显著影响,但个体特殊甲基化百分差异对多数性状产生显著的影响,并且受个体一般甲基化百分差异显著影响的性状,同样受个体特殊甲基化百分差异的显著影响,但是反之不然。 7.发现杂种性状随个体特殊甲基化百分差异的增加有三种变化趋势:(l)性状值随个体甲基化百分差异的增加而提高;(2)性状值随个体甲基化百分差异的增加而降低;(3)性状值随个体甲基化百分差异的增加而上下波动。 8.成功克隆、测序了22个对性状有显著效应的甲基化差异片段。结果5个片段在GenBank中搜索到同源序列,其余17个片段没有明显的同源序列。 9.进一步对上述22个克隆片段的序列特征进行了分析。它们在整个序列或序列的某一部分都有富含GC区域,即G+C%大于50%、实际CpG与理论预期的CpG之比大于0.6,按照哺乳动物 CpG岛的判断标准,表明这些序列来自GC岛。而且,一些序列含有潜在启动子区域序列,这进一步说明了这些序列可能来自基因的调控区域。 10.根据24个引物扩增的RAPD谱带在各品种内的分布情况,用Shannon公式分别计算6个猪品种的遗传多样性指数,梅山猪为0.1787,淮南猪为0.1778,通城猪为0.1600,大白猪为0.1416,八眉猪为0.1455,合作猪为0.1615。群体内平均遗传多样性指数(HP叩)为0.1622,总群体遗传多样性指数(HsP)为0.2534。 11.为了进一步了解遗传变异产生的机制,进而为制定保种措施提供依据,估测了遗传变异在群体内和群体间的分布。结果63.99%的变异来自群体内部,36.01%的变异来自群体间。 12.根据Rogers的遗传距离公式计算了6个猪品种的遗传距离,并对这6个猪群体进行了Neighbo卜Joining聚类分析,结果6个品种聚为三类,梅山猪、淮南猪、通城猪、八眉猪聚为一类(梅山猪和淮南猪首先相聚,再与通城猪相聚,最后与八眉猪相聚),合作猪,大白猪各为一类。