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1研究背景和目的溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)是一种直肠和结肠的慢性非特异性炎症性疾病,是炎症性肠病(IBD)的一种。病因病机复杂,迁延难愈,也是发生结肠癌最重要的三个高危因素之一,所以对于UC的治疗和发病相关机理研究至为重要。黄芩汤(HQT)出自《伤寒论》,功效清热止痢,和中止痛,被誉为“万世治痢之祖方”,用于治疗湿热下痢,现代广泛应用于UC的治疗。相对于化学药物的单一靶点治疗作用,中药复方成分复杂,具有针对病症多组分、多靶点、多通路的整体治疗作用,在多病因的复杂慢性疾病治疗中具有西药无法比拟的巨大优势和良好前景。在前期研究基础上,本课题围绕HQT对经典炎症TLR4/MyD88/NF-κB信号通路调控作用为出发点,观察HQT的抗炎效果,通过基因芯片技术筛选鉴定UC疾病发生发展相关基因,建立HQT调控UC相关基因表达图谱,并找出关键分子靶标。同时结合代谢组学研究,找出UC发病潜在的分子标志物。最终将基因组学与代谢组学桥接,多靶点多通路解释HQT对UC的治疗机制,为探寻UC发病机制及靶向治疗提供分子依据。2研究方法和结果2.1 HQT对UC大鼠TLR4/MyD88通路调控作用研究运用复合法(三硝基苯磺酸+乙醇)制备细胞免疫反应UC大鼠模型;将大鼠随机分为正常对照组、模型组、阳性药柳氮磺胺吡啶组(SASP)和HQT高中低剂量组(20、10、5g·kg-1)。除正常组外,其余组别均进行造模,造模第三天,开始灌胃给药。治疗3天后,对大鼠眼眶取血,采用Griess法测定血清中NO含量,ELISA法测定血清中炎症因子IL-4、IL-10、IL-17和PGE2含量;治疗5天后,处死大鼠取结肠,运用免疫组化法检测COX-2、iNOS蛋白的阳性表达,采用Western blot法检测大鼠结肠TLR4、MyD88的蛋白表达。结果显示,模型组血清中NO、IL-17、PGE2水平,结肠组织TLR4、MyD88蛋白表达量及COX-2、iNOS阳性表达均高于正常组(P<0.05); HQT高剂量组大鼠上述指标均较模型组显著好转(P<0.05)。说明HQT对UC的治疗作用可能是通过抑制TLR4/Myd88/NF-κB通路活化,进而下调促炎细胞因子NO、IL-17和PGE2的表达实现的。2.2基于全基因组表达谱探索HQT治疗UC大鼠的作用机制采用基因表达谱芯片技术,检测空白组、模型组和HQT组(20g kg-1)的基因表达谱,并进行差异表达数据分析。最终获得569个差异倍数大于1.5的UC相关基因。然后根据IPA数据库及Cytoscape软件进行网络分析,筛出HQT有效调节的有相互作用关系的 126 个基因,并发现 ITGB1、FN1、CASP3、LDLR、BMP4、FABP1、ABCB1、FABP2、SLC51B等关键靶标基因。结合疾病和功能富集分析,126个差异基因发生变化后,可能会引起的疾病和生物学功能上的变化主要集中在能量产生,脂质代谢,细胞发育,生长和增殖,神经系统疾病,组织损伤和异常、氨基酸代谢等方面。关键靶标基因与免疫应答、炎症、凋亡和代谢密切相关,且这些基因被揭示参与了多条炎症相关通路,如白血球粘附与渗出(Agranulocyte Adhesion and Diapedesis),整合素信号通路(Integrin Signaling),病毒活化的 NF-κB 通路(NF-κB Activation by Viruses), F AK 信号通路(FAK Signaling),PAK 信号通路(PAK Signaling),ERK/MAPK 信号通路(ERK/MAPK Signaling), PI3K/Akt 信号通路(PI3K/AKT Signaling)。2.3 HQT干预UC大鼠血清和尿液的非靶标代谢组学研究利用超高液相色谱-质谱(UPLC-MS)结合主成分分析(PCA)和偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA),对正常组、模型组、HQT组(20g kg-1)三组之间的代谢谱进行分析,血清和尿液代谢组学通路富集分析富集到的通路有:缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的生物合成;丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的代谢;花生四烯酸代谢;精氨酸和脯氨酸代谢;酮体的合成与降解;甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸代谢;酪氨酸代谢;色氨酸代谢;亚油酸代谢等。通过变量重要性投影(VIP)>1结合P<0.05筛选血清中潜在的生物标志物。与正常组相比,模型组大鼠血清中发现并鉴定出缬氨酸、色氨酸、乳酸、尿素等16个潜在生物标志物。与模型组相比,给予HQT治疗10d后,上述潜在生物标志物有向正常水平回调的趋势。代谢组学分析揭示HQT对UC大鼠具有一定的治疗作用,其机制可能与调节氨基酸代谢、能量代谢和脂代谢等有关。3结论本文通过对TLR4/MyD88/NF-κB经典炎症通路的研究,明确了 HQT在治疗UC过程中发挥着重要的抗炎作用。基因芯片获得了 126个HQT有效调节的UC差异基因并筛选出20个关键靶标基因,这些基因主要与炎症反应、代谢、免疫系统有关。基于UPLC-MS检测的代谢组学筛选到与病证相关的特异性生物标记物,分析HQT对UC大鼠体内紊乱的氨基酸代谢、能量代谢和脂肪酸代谢具有调节作用。同时,结合基因和代谢网络作用分析发现,“上游”具有脂肪酸氧化和转运功能的基因表达降低,可能是导致“下游”代谢产物中脂肪酸堆积的直接原因,而脂肪酸大量堆积,可能是UC炎症发生发展的重要因素;与细胞迁移和增殖有关的基因功能被激活,则可能是UC疾病炎症反应加剧的直接原因。本研究对于阐明HQT治疗UC多通路、多靶点的作用机制网络以及诠释中医辨证治疗的整体观思想都具有重要的意义。