猪圆环病毒2型（Porcine Circovirus Type 2,PCV2）为圆环病毒科圆环病毒属成员,可引起断奶仔猪多系统衰弱综合征及母猪繁殖障碍等一系列猪相关疾病,疫苗免疫是预防PCV2的一种有效手段。由于临床上PCV2阴性猪极少,且猪动物模型成本高,因此,本研究选择小鼠动物模型评价不同PCV2商品疫苗的免疫保护效果。猪痘病毒（Swinepox Virus,SWPV）具有宿主单一、基因组大、复制非必须区多的特点,可作为基因工程疫苗载体的选择。本研究从猪痘病毒150个阅读框随机选择22个阅读框,采用融合PCR和同源重组方法构建22个阅读框的基因缺失毒株,并测定其部分生物学特性,以期筛选到可用于高表达外源基因的复制非必须区。1.PCV2荧光定量PCR方法的建立根据PCV2 ORF1序列（Gen Bank登录号:MG744311.1）设计引物和探针,采用酶切连接构建标准品质粒PUC19-TK1-ORF1-TK2,建立荧光定量PCR体系。结果表明:PCV2荧光定量PCR的反应体系为50℃2min,95℃30 s,95℃10 s,60℃34s,共40个循环;标准曲线的斜率为-4.5,截距为47.76;该方法的敏感度可以达到8拷贝/μL,比传统PCR方法的灵敏度提高了100倍,为PCV2感染小鼠动物模型提供了PCV2的定量检测方法。2.PCV2感染小鼠动物模型的建立及其对商品疫苗的评价本研究选择6～8周龄的雌性ICR小鼠,腹腔注射PCV2病毒液,设定不同感染量(1010、10~9、10~8、10~7、0拷贝数/只)及感染后不同宰杀时间（5d、10d、15d、20d、30d）,通过荧光定量PCR方法测定小鼠肺脏的PCV2病毒含量,确定PCV2对ICR小鼠的最佳感染量及感染后最佳宰杀时间。结果表明,PCV2对6～8周龄雌性ICR小鼠的最佳感染量为1×1010拷贝数,感染15天后小鼠肺脏的PCV2含量最高。选择PCV2商品疫苗A、B、C、D、E作为评价对象,腿部肌肉注射ICR小鼠,左右腿各注射25μL,90d后,腹腔注射1×1010拷贝数/只的PCV2病毒液,感染后15d宰杀小鼠,使用荧光定量PCR方法测定小鼠肺脏中PCV2病毒含量,比较不同商品疫苗的免疫保护效果。结果表明,PCV2不同商品疫苗对6～8周龄雌性ICR小鼠的免疫保护效果不一样,其中疫苗A的免疫保护效果最佳。PCV2感染小鼠动物模型的建立为PCV2商品疫苗的评价提供了可行的评估办法。3.猪痘病毒江西分离株NER缺失毒株的构建本研究从猪痘病毒150个阅读框随机选择22个阅读框作为复制非必须区的筛选区域,根据SWPV-JX20G株全基因序列设计扩增左右臂的引物,以猪痘病毒SWPV-JX20G株为模板扩增得到左右臂,EGFP-P11-P28-ORF2作为外源插入基因,采用融合PCR方法构建22个基因片段,通过转染和纯化得到22株猪痘NER缺失毒株,感染PK15细胞后均可看到明显的绿色荧光,说明外源基因EGFP均已稳定表达,22个基因均为猪痘病毒SWPV-JX20G株的复制非必须区。4.猪痘NER缺失毒株的生物学特性测定通过测定22株缺失毒株感染PK15细胞后的荧光斑大小、对保育猪的致病性、PCV2-Cap表达量、对ICR小鼠的免疫保护效果实验,结果如下:（1）22株缺失毒株感染PK15细胞后均可看到100%荧光,说明22株猪痘NER缺失毒株均可在PK15细胞的正常增殖;（2）Western blotting结果表明,22株缺失毒株表达PCV2-Cap有明显差异,ORF014、ORF042、ORF052、TK、ORF099、ORF107、ORF121、ORF126、ORF142、ORF144、ORF145共11株缺失毒株表达量高,ORF008、ORF012、ORF015、ORF017、ORF038、ORF133、ORF143共7株缺失毒株PCV2-Cap表达量低;（3）通过不同NER缺失毒株对猪的致病性结果可知,ORF008、ORF121缺失毒株痊愈快,痘斑小,ORF009基因缺失后会使缺失毒株对保育猪的致病能力增强;（4）通过测定不同NER缺失毒株对小鼠保护效果可知,ORF008、ORF009、TK、ORF107、ORF121、ORF141、ORF143共7株缺失毒株对小鼠保护效果明显,ORF012、ORF133缺失毒株对小鼠保护效果差,对小鼠基本不产生保护效果。综上可知,ORF008、ORF121、ORF133疑为猪痘病毒的毒力相关基因,ORF014、ORF042、ORF052、ORF099、ORF107、ORF121、ORF126、ORF142、ORF144、ORF145可作为外源基因的高表达位点。