北沙参多糖的分离纯化、结构表征及其生物药理活性研究

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北沙参(Glehniae radix)为伞形科植物珊瑚菜(Glehnia littoralis Fr.Schmidtex Miq)的干燥根。本品味甘、微苦、性微寒,归肺、胃经。有养阴清肺、益胃生津之功效。主要用于肺热燥咳、劳嗽痰血、胃阴不足、热病津伤等症,为临床常用中药。研究表明,北沙参中多糖类成分所占比例最大,也是其主要有效成分之一。本课题以北沙参药材为原料,采用水提醇沉法提取北沙参粗多糖,对其进行分离纯化得北沙参均一多糖组分GRP(Glehniae radix polysaccharide),并对GRP的理化性质、结构组成以及体外药理活性进行了深入研究,具体研究内容与结果如下:1)北沙参多糖GRP的分离纯化和理化性质研究以北沙参药材为原料,对其进行热水浸提、乙醇沉淀、冷冻干燥,得北沙参粗多糖,呈浅黄色粉末状。粗多糖经DEAE-52阴离子交换柱和Sephadex G-75葡聚糖凝胶柱层析后得到北沙参多糖组分GRP。高效凝胶渗透色谱法分析结果表明GRP为均一多糖,重均分子量?Mw为1.33×104 Da,苯酚-硫酸法分析结果显示GRP中总糖含量为95.87%,考马斯亮蓝法分析结果表明GRP中蛋白质含量为0.22%。2)GRP的结构研究GRP经完全酸水解、柱前衍生化处理后,利用高效液相色谱法及气相色谱法分析其单糖组成,结果显示GRP仅由葡萄糖组成。红外光谱表明GRP除了具有多糖的特征吸收峰外,还显示有α-D-吡喃糖的特征峰,提示GRP由α-D-吡喃葡萄糖组成的葡聚糖。紫外光谱扫描结果显示GRP中含有微量的蛋白质和核酸类成分。高碘酸氧化及Smith降解结果表明GRP中含有1→6(或1→)、1→4和1→3糖苷键,摩尔比为14.3:1.0:1.2。GRP经甲基化、酸水解和乙酰化处理后,用GC-MS技术分析衍生化产物,根据结果可知GRP主要由(1→6)-Glcp、(1→3)-Glcp、(1→6,4)-Glcp和末端葡萄糖组成,其摩尔比为12.8:1.1:1:1.3。部分酸水解结果显示GRP的主链由(1→3)-Glcp和(1→6)-Glcp构成,结合甲基化结果可推测末端葡萄糖和1个(1→6)-Glcp位于侧链。核磁共振波谱(1H NMR及13C NMR)表明GRP结构中含有四种不同连接类型的葡萄糖。结合1H 1H COSY、1H 13C HMBC和13C DEPT谱对GRP中C、H化学位移进行归属。综上所述,GRP的可能结构如下:(?)3)GRP的体外药理活性研究MTT法测定GRP体外对脾脏细胞和巨噬细胞增殖活性的影响,结果显示GRP可明显促进这两种免疫细胞的增殖,且在一定浓度下,呈现剂量依赖性,说明GRP具有较好的免疫促进作用。体外抗肿瘤活性表明,GRP能够抑制人肺癌细胞株A549的增殖,该作用效果随着浓度的升高呈现钟罩型的剂量-效应曲线,表明GRP有一定的抗肿瘤作用。一定浓度的GRP作用于LPS作用的RAW264.7细胞,能够降低其NO和IL-2炎症因子的表达,说明GRP具有潜在的抗炎作用。本课题首次从北沙参中分离得到均一的多糖组分GRP,研究了GRP的理化性质,确定了GRP的分子结构,并对GRP进行了体外免疫调节、抗肿瘤和抗炎活性研究,结果显示GRP具有较好的免疫促进作用,潜在的抗肿瘤和抗炎作用。为北沙参多糖类物质的研究与开发提供一定的理论指导,也为多糖结构和功能关系的阐述奠定了一定的理论基础。
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