由疟原虫引起的疟疾目前仍是影响热带及亚热带地区数百万人口的主要流行病。然而目前并没有能够广泛临床应用的有效抗疟疫苗,包括青蒿素在内的抗疟药物也面临了严重的抗药性问题。要解决这些问题,急需我们对疟原虫认知的深入研究和累积。恶性疟原虫(Plasmodium.falciparum,P.falciparum)是感染人类的疟原虫中致死率最高的病原体。恶性疟原虫感染人体后经历肝细胞期和红细胞期两个阶段。红细胞期是恶性疟原虫在人体内生长、发育、增殖和产生临床症状的主要阶段,其能量代谢主要依赖于吸收血液中的葡萄糖。葡萄糖首先通过宿主红细胞膜(erythrocyte plasma membrane,EPM)上的葡萄糖转运蛋白1(Glucose transporter 1,GLUT1)进入红细胞胞浆,再由疟原虫质膜(parasite plasma membrane,PPM)上的己糖转运蛋白(P.falciparum hexose transporter,PfHT)完成疟原虫对葡萄糖的吸收。很多肿瘤相关研究指出,维生素C(抗坏血酸)对包括结直肠癌细胞在内的很多肿瘤细胞的生长有抑制作用。其机制与肿瘤细胞吸收氧化形式维生素C(脱氢抗坏血酸,DHA)增加有关。细胞能够通过糖转运通道GLUT1吸收DHA。很多肿瘤细胞通过GLUT1表达量上调来满足自身增殖需要,因此也能够吸收较正常细胞更多的DHA,而大量吸收的DHA在细胞内还原成维生素C,消耗谷胱甘肽,进而造成细胞氧化应激,导致肿瘤细胞死亡。与这些肿瘤细胞类似,红细胞膜上GLUT1表达量丰富,并且感染疟原虫的红细胞由于疟原虫的额外生长需要从而正向调节自身对糖的摄取和代谢,所以感染疟原虫的红细胞可能也会吸收更多的DHA。于是我们对体外培养恶性疟原虫给予维生素C治疗,共分为三组(1)不同剂量组;(2)不同作用时间组;(3)不同给药时间组。通过对血涂片疟原虫虫血率的计数和统计发现:(1)维生素C药物浓度3mM以上,作用时间24小时对恶性疟原虫生长产生抑制作用;(2)维生素C药物浓度20mM,作用3小时对恶性疟原虫的生长产生抑制作用甚至将其杀灭;(3)维生素C在不同时间给药均对恶性疟原虫的生长有不同程度的抑制作用。并且药物治疗后恶性疟原虫出现细胞核缩小、细胞质减少的形态改变。因此,体外培养的红细胞期恶性疟原虫药物治疗的研究证实了高剂量维生素C在生理作用时间内能够有效的抑制其生长、发育和增殖。GLUT1是红细胞膜上转运葡萄糖和维生素C的共同通道蛋白。相关研究表明,未感染和感染恶性疟原虫的红细胞GLUT1表达量并无明显差异,而其磷酸化水平可能存在差异。由此可见,人红细胞膜上的葡萄糖转运蛋白对恶性疟原虫生长和增殖有重要影响。为了进一步了解GLUT1对恶性疟原虫红细胞期增殖的功能作用和维生素C抑制疟原虫生长的机制,我们利用质谱检测方法对相同细胞数的感染恶性疟原虫的红细胞GLUT1的表达量和磷酸化水平进行比较,发现了感染恶性疟原虫的红细胞上的GLUT1的2个磷酸化位点,未感染红细胞未检测到磷酸化的位点,这也与相关研究结果一致。红细胞膜上GLUT1蛋白表达量丰富,但我们在通过蛋白免疫印迹实验定量检测GLUT1表达量时发现,实验中所使用的商品化抗体在蛋白样品的检测中存在抗体灵敏性和稳定性欠佳的问题,而且无法成功的用于免疫沉淀实验。此外,对于位于疟原虫质膜上的同样影响葡萄糖转运的通道蛋白PfHT,至今并没有针对该蛋白的商品化抗体以供科学实验研究使用。为了进一步研究针对恶性疟原虫红细胞期葡萄糖转运途径中的关键蛋白的作用,我们分别对目的蛋白进行序列和结构的分析,合成了相应多肽,获得了能够特异性识别GLUT1和PfHT蛋白的抗体。利用红细胞期恶性疟原虫体外培养和富集技术获得虫血率达90%以上的感染疟原虫的红细胞样本,提取蛋白,再利用分子克隆技术和免疫印迹实验完成了针对GLUT1和PfHT蛋白的定制抗体的验证。我们的研究证实了高剂量维生素C在生理作用时间内能够有效的抑制恶性疟原虫的生长。同时,针对GLUT1和PfHT分别定制的抗体能够有效应用于蛋白免疫印迹实验,也为后续免疫沉淀、免疫荧光实验等研究手段提供重要材料。本研究有助于深入研究葡萄糖转运途径中关键蛋白在恶性疟原虫感染、发育和增殖过程中的作用,也为进一步探索抗疟药物治疗新靶点提供了条件。