作为全球三大粮食作物之一,小麦供养着30%以上的世界人口。而随着全球气候变暖、海平面上升、环境污染加重和城市化进程加速,土壤盐渍化这一现象日益严重,业已成为限制全球小麦产量的重要因素。DNA甲基化是表观遗传修饰的一种,在植物体内具有重要的作用。一方面,DNA甲基化通过沉默转座子等功能来维持植物基因组的稳定性,远缘杂交、异源多倍体化等引起的基因组冲击可以导致DNA甲基化的重塑；另一方面,DNA甲基化可以调控植物功能基因的表达,尤其是植物遭遇盐、旱等非生物胁迫时,非生物胁迫应答基因的DNA甲基化状态迅速发生动态变化,实现应答基因表达的诱导或者抑制。本研究从本实验室前期通过体细胞杂交创制的耐盐小麦渐渗系品种山融3号出发,对比其亲本普通六倍体小麦品种济南177,证实了小麦盐胁迫应答基因的表达受到其启动子区域的DNA甲基化修饰调控,并发现了体细胞杂交过程的基因组冲击可以导致小麦DNA甲基化的重塑,这种重塑对于山融3号的耐盐性状具有一定的意义。同时,鉴定出小麦中5个表达受DNA甲基化调控的盐胁迫应答基因,并在拟南芥和小麦中初步证实了这些基因对于植物响应盐胁迫的作用。进一步的,从遗传变异、DNA甲基化变异、表达差异和蛋白功能差异等角度详细阐释了小麦耐盐关键基因HKT1；5不同染色体组上部分同源基因的进化命运。1小麦渐渗系盐胁迫应答基因的DNA甲基化修饰调控研究通过HPLC和MSAP实验的数据分析,发现小麦在受到盐胁迫时,全基因组水平的DNA甲基化状态发生重塑。进一步利用亚硫酸盐法对小麦中24个盐胁迫应答基因进行DNA甲基化测序扫描发现,编码区的胞嘧啶甲基化几乎全部存在于CpG位点,盐处理后这些位点的甲基化状态变化与基因表达的变化没有明显的对应关系。对于只在编码区存在甲基化修饰的基因,DNA甲基转移酶抑制剂5-azaC处理之后,这些基因编码区发生显著的去甲基化现象,但是其表达并没有发生变化,说明小麦中编码区DNA甲基化对于基因表达的调控作用不显著。统计分析显示,小麦中基因启动子区域的甲基化不仅存在于CpG位点,在CpNpG和CpNpN位点也有一定比例的存在。盐处理后,启动子区域胞嘧啶位点的甲基化状态发生变化,这种变化与对应基因的表达呈现“去甲基化-基因表达上调,超甲基化-基因表达下调”的规律。进一步用5-azaC处理,显示启动子区域发生显著的去甲基化现象,对应基因的表达被显著的诱导,说明小麦中基因启动子区域DNA甲基化对于基因的表达具有调控作用。虽然HPLC分析显示体细胞杂交渐渗系小麦SR3与其母本JN177全基因组整体水平上DNA甲基化修饰比率基本相同,但是MSAP实验碱基水平显示SR3与JN177之间许多胞嘧啶位点的甲基化状态是不同的。更高分辨率的亚硫酸盐测序数据表明,有21个胞嘧啶位点只在JN177中存在甲基化修饰,有10个位点则只在SR3中存在甲基化修饰。这些数据说明体细胞杂交过程中引起的基因组冲击可以导致小麦DNA甲基化的重塑。进一步分析表明,这种DNA甲基化的重塑对于SR3的耐盐表型具有一定的意义。MSAP数据统计发现,对照情况下的SR3与盐胁迫下的JN177有13个位点的甲基化状态是一致的,这使得SR3中这些位点的DNA甲基化模拟了部分小麦盐胁迫的响应状态,从而导致SR3可以更加快速地应答盐胁迫。更有趣的是,通过亚硫酸盐测序,发现SR3和JN177之间一些基因启动子区域的甲基化水平存在差异,而且这种差异还与相应基因在SR3和JN177之间的差异表达也存在一定的对应关系。2小麦TaCYP81的克隆与耐盐功能初步研究从上部分内容出发,发掘了一个受启动子区域DNA甲基化调控而在SR3与JN177中盐胁迫下表达模式存在差异的小麦TaCYP81基因。进一步研究发现,TaCYP81不仅在基因表达上受到盐胁迫、过氧化氢胁迫的强烈诱导,而且其蛋白也受到盐胁迫和过氧化氢胁迫影响而快速聚集到内质网上,这与前人发现的拟南芥、水稻、大豆、苜蓿等植物中此家族基因受到非生物胁迫时诱导表达的研究结果是一致的。将该基因在拟南芥中异源表达和在小麦中过表达,可以显著提高拟南芥和小麦的耐盐性。同时,发现TaCYP81还可以降低拟南芥对于过氧化氢胁迫的敏感性。进一步的生理实验和拟南芥ROS清除酶实时定量PCR结果显示,TaCYP81可以促进拟南芥的ROS清除能力,推测TaCYP81提高小麦和拟南芥的耐盐性的功能与其促进植物ROS清除能力有关,需要进一步的实验验证。3小麦耐盐关键基因HKT1；5不同染色体上部分同源基因的进化研究在第一部分研究过程中,发现对TaHKT1;5亚硫酸盐测序时总是可以得到两个部分同源的序列样本,且两种序列样本的DNA甲基化状态存在显著性差异,进一步从遗传变异、表观遗传变异、表达差异和蛋白结构功能差异等角度,证实了小麦不同拷贝HKT1；5基因的不同进化命运：(1)HKT1；5-A只在小麦二倍体祖先近缘种T.monococcum中存在,也是T.monococcum的耐盐主效基因,推测进化过程中由于4AL和5AL的染色体易位等原因而在四倍体小麦和六倍体小麦中丢失；(2)HKT1;5-B1在二倍体小麦祖先种的根中正常表达,进化过程中虽然基因序列几乎没有发生变化,但是在四倍体小麦和六倍体小麦的根中由于DNA超甲基化而呈现低表达；(3)HKT1；5-B2在二倍体小麦祖先种的根中正常表达,但是在进化过程中由于启动子区域的重复序列插入,而在四倍体小麦和六倍体小麦中呈现超低表达；(4)HKT1；5-B3在进化过程中由于编码区的大片段插入而在四倍体和倍体小麦中成为假基因；(5)HKT1；5-D在六倍体面包小麦中为耐盐座位Kna1的主效候选基因,其基因序列在二倍体小麦祖先种和六倍体小麦之间几乎没有差异,其表达量在二倍体小麦祖先种的根中相对六倍体小麦要高2倍左右,但是HKT1；5-D在根中不受DNA甲基化调控。通过3D蛋白结构模型预测和酵母突变体互补实验,证实HKT1;5-B1也是具有钠离子转运功能的通道蛋白,转运能力略低于TmHKT1;5和TaHKT1;5-D。但是如前所述,HKT1；5-B1在四倍体小麦和六倍体小麦的根中因为DNA超甲基化而呈现低量表达,故其在小麦耐盐性的贡献上一直没有受到重视。通过DNA甲基转移酶抑制剂5.azaC的预处理四倍体小麦LDN, HKT1;5-B1发生去甲基化而被诱导表达,进一步盐胁迫表型实验发现HKT1；5-B1的表达被激活后小麦的耐盐性得到了一定的提高,叶片中的钠离子积累程度也得到一定的降低,说明HKT1;5-B1如果在根中被激活可以促进四倍体小麦的耐盐性。