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中国汉族瘢痕疙瘩致病基因初步连锁分析和相关基因多态性的研究前言瘢痕疙瘩(Keloid)是易感个体在皮肤损伤修复过程中成纤维细胞大量增殖,胶原基质大量分泌形成的良性真皮肿瘤,临床特征为瘢痕组织超越原有损伤范围,侵袭周围外观正常皮肤,手术切除后易复发。虽然国内外许多学者对其进行了大量的研究,但发病机制目前尚不清楚。随着遗传学特别是分子遗传学的发展,遗传因素在疾病发生和发展中所起的作用被越来越多的学者重视。大量的研究显示,遗传在本病的发生中起着至关重要的作用,且存在着明显的遗传异质性。Marneros等通过对一个瘢痕疙瘩日本家系和一个非洲裔美国人家系的家族成员进行全基因组扫描,将瘢痕疙瘩易感基因分别定位于2q23和7p11,为下一步寻找和克隆致病基因,揭示瘢痕疙瘩发生的遗传本质打下了坚实的基础。由于两个家系的易感基因定位在不同的染色体区域,提示瘢痕疙瘩的发生存在明显的遗传异质性。目前国内还没有关于瘢痕疙瘩易感基因成功定位的报告。研究证实瘢痕疙瘩成纤维细胞大量增生和凋亡相对减少与p53基因的功能状态密切相关。p53基因是一种重要的肿瘤抑制基因,在凋亡调控过程中起着关键性作用。人p53基因第72密码子存在CGC/CCC单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphisms,SNP),其编码的氨基酸分别为精氨酸(Arg)和脯氨酸(Pro),两种p53蛋白的结构和活性存在一定差异,p53Pro蛋白诱导凋亡的能力比p53Arg明显减弱。p73基因是p53家族成员之一,p73蛋白在结构与p53蛋白具有同源性,可以激活一些p53应答基因的转录,从而参与细胞周期调控、DNA修复和凋亡,并且以与p53同样的方式通过诱导凋亡或G1期细胞停滞来抑制细胞增殖。有研究发现在p73基因第二外显子非编码区存在两个连锁的单核苷酸多态性(G4C14-A4T14),两个SNP可形成茎环结构而影响基因的表达。有研究表明p53和p73的这两个功能性SNP可能存在相互作用,能够影响一些肿瘤发生的易感性。超强的炎症反应可能会促进瘢痕疙瘩的发生和发展。单核细胞趋化蛋白-1(Monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)是一种重要的细胞趋化因子,由创伤部位的成纤维细胞、上皮细胞、粒细胞等细胞合成,能特异性的募集单核/巨噬细胞游走到创伤部位参与炎症过程,在创伤愈合中起着关键作用。研究发现MCP-1基因启动子区-2518位点存在G/A多态性,具有重要的生物学意义,进一步的研究发现,此多态性可能与炎症及纤维化疾病发生的易感性相关。本研究从分子遗传学角度入手,对瘢痕疙瘩发病机制的分子基础进行研究。首先利用两个瘢痕疙瘩大家系,对2q23和7p11两个区域分别进行连锁分析,以确定中国汉族瘢痕疙瘩的易感基因位点是否与染色体2q23或7p11区域的微卫星标记存在连锁关系。同时应用聚合酶链反应—限制性片段长度多态性(Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)方法和相对的两对引物—聚合酶链反应(Polymerase chain reaction with confronting two-pair primers,PCR-CTPP)方法对92例辽宁籍汉族瘢痕疙瘩患者和180例种族与地域相匹配的正常对照者的p53、p73和MCP-1基因的多态性位点进行检测,以探讨这些功能性SNP位点与瘢痕疙瘩的遗传易感性的关系,为揭示瘢痕疙瘩遗传学发病机理提供重要线索。材料和方法一、研究对象1、两个辽宁汉族瘢痕疙瘩家系。2、病例组:92例瘢痕疙瘩患者为中国医科大学附属第一医院皮肤科门诊及住院患者,符合临床诊断标准:增生瘢痕组织超过原损伤范围,病程大于1年。所有患者均为彼此间无血缘关系的辽宁籍汉族人,其中男性44例,女性48例,发病年龄12~52岁,平均年龄26.4(±5.9)岁。3、正常对照组:180例,为随机抽取的健康体检志愿者,其中男84例,女96例,平均年龄24.3(±2.7)岁,彼此间无血缘关系,排除瘢痕疙瘩病史及家族史。二、实验材料10%SDS、EDTA、蛋白酶K、Tris饱和酚、氯仿、醋酸钠、无水乙醇、TE缓冲液、琼脂糖、8%变性聚丙烯酰胺溶液、LA Taq酶、限制性内切酶styⅠ、限制性内切酶AccⅡ、限制性内切酶PvuⅡ。三、实验方法1、应用聚合酶链式反应(PCR),变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和银染技术,对微卫星标记D2S1328、D2S1334、D2S349、D2S1399、D2S356、D7S473、D7S499、D7S1830进行等位基因分型,判断连锁关系。2、应用聚合酶链反应—限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法对p53 Arg/Pro、p73 C14T以及MCP-1 G/A等位基因进行分型。3、应用相对的两对引物—聚合酶链反应(PCR-CTPP)方法对p73 G4A等位基因进行分型。四、统计学处理用LINKAGE(Version 5.2)软件包中的MLINK软件,对所采用的微卫星位点进行两点连锁分析,计算LOD值。根据Hardy-Weinberg平衡定律计算各基因型个体数的期望值。Hardy-Weinberg平衡吻合性检验、组间基因型频率及等位基因频率的差异性比较采用x2检验,并以优势比(odds ratio,OR)及其95%可信区间(confidence interval,CI)表示相对风险度。使用SPSS 13.0软件分析数据,认为P<0.05有统计学意义。结果1、瘢痕疙瘩致病基因位点连锁分析结果(1)两个家系均符合常染色体显性遗传。(2)两个家系的所有微卫星标记LOD值均为负值。2、瘢痕疙瘩与p53、p73基因多态性的相关研究(1)瘢痕疙瘩组和正常对照组人群p53 Arg/Pro、p73 G4C14-A4T14基因型及等位基因频率分布符合Hardy-Weinberg平衡定律。(2)瘢痕疙瘩组p53基因Arg/Pro等位基因的频率与正常对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。瘢痕疙瘩组p73基因GC/AT等位基因的频率与正常对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。(3)瘢痕疙瘩组中Arg/Arg基因型和GC/AT基因型同时存在的频率较正常对照组明显升高,差异有统计学意义(16.3%vs 6.7%,x2=6.325,P=0.012,OR=2.727,95%CI:1.219~6.104)。3、瘢痕疙瘩与MCP-1基因多态性的相关研究(1)瘢痕疙瘩组和正常对照组人群MCP-1基因启动子区-2518基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律。(2)瘢痕疙瘩组MCP-1基因-2518G/A等位基因的频率与正常对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。(3)瘢痕疙瘩多发组AA和AG基因型(A等位基因携带者)频率(83.8%)明显高于单发组(63.6%,x2=4.429,P=0.035,OR=2.952,95%CI:1.051~8.290)。结论1、两个瘢痕疙瘩家系的易感位点可能不在染色体2q23和7p11区域。2、瘢痕疙瘩存在遗传异质性。3、瘢痕疙瘩组和正常对照组人群p53、p73和MCP-1基因频率已达到Hardy-Weinberg遗传平衡。4、单独比较p53基因Pro/Arg等位基因在瘢痕疙瘩人群和正常人群中的分布频率时,差异无统计学意义。单独比较p73基因GC/AT等位基因在两组人群中的分布差异时,结果亦无统计学意义。5、同时携带p53基因Arg/Arg基因型和p73基因GC/AT基因型的个体,较携带其他基因型组合的个体,发生瘢痕疙瘩的风险增高了约2.7倍。6、MCP-1基因启动子区-2518位A等位基因的存在可能与多发性瘢痕疙瘩的形成和发展有一定的相关性。