稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)是生产中最具破坏性的致病真菌之一,每年可造成10%-30%的粮食产量损失。随着稻瘟病菌及其宿主水稻全基因组序列测序工作的完成,加快了对病原菌致病性相关基因的研究进程,同时也为研究宿主-病原菌相互作用提供了理论基础。从分子水平解析稻瘟病菌致病及变异机制对有效防控该病害的发生及发展具有重要的理论与实践意义。目前,稻瘟病菌主要通过基因敲除、过表达和荧光蛋白融合等方法来进行基因功能研究。但是,大部分基因重组整合位点往往是随机的,由此带来的位置效应可能会干扰基因自身或是相关功能基因的表达。本研究利用紫外线(UV)对稻瘟菌进行辐射突变,获得一株萎锈灵抗性菌株,经测序发现,该突变菌株琥珀酸脱氢酶B亚基(sdi1)第245位氨基酸发生突变。利用该点突变(H245L)作为筛选标记,对已知载体pCAMBIA1300进行改造,使其成为具有萎锈灵抗性筛选标记,并能定点插入Mosdi1位点的重组载体pMoC-eGFP。通过农杆菌介导的转化方法得到pMoC-eGFP定点重组的突变体,对抗性菌株进行PCR及Southern杂交验证,表明该载体定点、单拷贝整合至基因组Mosdi1位点的效率高。实验结果表明,突变株在产孢量、孢子形态、生长速率等方面与野生型菌株相比未发生明显改变,同时,突变体对大麦和水稻(敏感品种CO-39)的致病性也未发现明显的变化。因此,可以将Mosdi1位点作为目的基因整合位点,以实现目的基因在稻瘟菌株中的稳定表达。此外,该载体包含酵母重组区,可以不依赖限制性酶切位点,实现多个DNA片段的一步连接。与传统基因回补及定位研究方法相比,该系统快速、高效等优点,对稻瘟病菌基因功能研究具有重要的意义。目前,本实验室利用该定点整合系统,完成了稻瘟菌Morak1、Mopmt2及Mokhd4三个基因的定点回补及定位载体构建工作。上述部分菌株进行Southern杂交及半定量RT-PCR验证,表明突变体中目的基因均以单拷贝形式整合在Mosdi1位点下游。以上结果进一步表明,在上述系统的帮助下,可高效、快速完成靶标基因回补转化子及定位菌株的构建,对稻瘟病菌基因功能研究起到重要的推动作用。