3-巯基丙酮酸硫转移酶产生的H2S对大鼠脑血管张力和其内皮细胞缺氧性损伤的影响

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背景:脑血管病是一种常见的临床疾病,缺血性脑血管病更常见,是全球主要的公共卫生问题,但是其发生发展的病理生理机制仍不是十分清楚。脑缺血的损伤严重程度取决于组织受血流限制的时间,并且在较长的缺血时间后变得更严重。这可能导致许多并发症,例如组织坏死,细胞凋亡,炎症,代谢和线粒体功能障碍,甚至器官衰竭。硫化氢,其是一种能够通过扩散穿过细胞膜的气体递质,对调节细胞存活的各种信号传导途径发挥作用。内源性硫化氢作为重要的气体信号分子,如同NO一样,参与血管调节。它主要由胱硫醚-β-合成酶(l-cystathionine-?-synthetase,CBS),胱硫醚-γ-裂解酶(L-cystathionine-γ-lyase,CSE)催化半胱氨酸(l-cysteine,L-Cys),以及3-巯基丙酮酸硫转移酶(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase,3-MST)联合半胱氨酸氨基转移酶催化生成H2S。我们课题组前期研究了CSE产生的H2S对脑血管的作用。证明CSE产生的H2S可舒张脑血管,对小鼠脑损伤具有保护作用。3-MST也是重要的产生H2S的酶,但是,迄今为止,关于3-MST及其产生的H2S的调节作用知之甚少。因此,本文研究3-MST产生的H2S及其对缺氧损伤的内皮细胞的影响。目的:(1)研究3-MST产生的H2S对大鼠BAs的舒张作用(2)研究3-MST产生的H2S对脑血管BAs内皮细胞的保护作用方法:(1)四通道血管张力测定仪检测大鼠BAs张力变化;(2)大鼠脑血管内皮细胞原代培养,鉴定以及内皮细胞缺氧模型的建立;(3)MTT检测细胞活力和LDH检测乳酸脱氢酶含量;(4)亚甲蓝法检测H2S含量;(5)荧光法检测活性氧水平;(6)采用Western-Blot检测3-MST产生的H2S对大鼠脑血管内皮细胞3-MST蛋白表达的影响。结果:(1)3-MST抑制剂天冬氨酸(L-Aspartic Acid,ASP)(1×10-5.51×10-33 mol/L)有引起血管收缩的趋势,但是差异没有统计学意义;与对照组相比,ASP对U46619预收缩的血管环无明显影响;(2)3-MST底物硫基丙酮酸(3-mercaptopyruvate,3MP)可以舒张U46619收缩的血管;其激动剂5-氨基-3-(4-吗啉基)1,2,3-恶二唑鎓盐酸盐(3-MorpholinoSydnonimine Hydrochloride,SIN-1)也能够舒张大鼠脑基底动脉,并且具有浓度依赖性;与内皮完整的血管环相比,去内皮的血管环在1×10-4.5,1×10-4mol/L时舒张作用减弱;ASP能够减弱SIN-1对血管的舒张作用,3MP能够增强SIN-1的舒血管作用。(3)与Control组比较,ASP(10-3mol/L)对H2S的含量没有显著影响;而3MP增加了H2S的含量,用SIN-1也显著增加了H2S的含量;与单用SIN-1比较,ASP能够降低SIN-1增加的H2S,而3MP能够使H2S含量进一步增高。(4)细胞缺氧后,ASP可降低内皮细胞的存活率,增加上清液中LDH;单独使用3MP和SIN-1可以提高内皮细胞的存活率并降低上清液中的LDH;与SIN-1比较,3MP可以进一步提高内皮细胞的存活率,降低上清液中LDH含量。(5)细胞缺氧后,内皮细胞H2S含量显著下降;ASP能够抑制H2S的释放,3MP和SIN-1能够促进H2S的释放;3MP合用SIN-1可以进一步提高H2S的释放量。(6)细胞缺氧后,3MP和ASP对活性氧水平无明显影响,SIN-1能够降低活性氧水平,NaHS可以降低活性氧水平。(7)对于缺氧后的内皮细胞,与Control比较,ASP降低了3-MST的表达,而SIN-1和3MP一起能够增加3-MST的表达。结论:(1)3-MST产生的H2S对大鼠脑基底动脉有舒张作用。(2)3-MST产生的H2S对缺氧的脑血管内皮细胞有保护作用。
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