tPA(tissue-typeplasminogenactivator)是活性和特异性最强的一种溶栓药物，但在体内短暂的半衰期很大程度上阻碍着该药发挥应有的作用。本文设想更高活性的tPA能在一定程度上缓解这一矛盾。 DNA改组(DNAshuffling)技术的问世为人们获得更高活性的基因表达产物提供了一个全新的技术平台。然而，迄今为止DNA改组仍只限于对原核表达产物有活性的一组基因的改组，对那些只有真核表达才有活性的基因的改组，由于筛选中存在的一系列困难而受阻。所以真核表达改组是人们努力的一个方向。本研究对这一技术在tPA分子定向进化中应用的可能性进行了探讨，期望这一探索性结果能够为后续几轮的tPADNA改组探明道路，为最终从改组后tPA多样性基因库中筛选到比较理想的重组体打下基础，也为其它需要以真核表达为基础的DNA改组提供可借鉴的经验。 首先采用RT-PCR方法获得一组哺乳类动物tPA的cDNA基因，包括大白鼠、恒河猴、人的tPAcDNA。将这些基因分别进行克隆、测序、原核与真核表达。测序结果表明恒河猴tPAcDNA编码区(含信号肽)与发表的人tPAcDNA编码区的核苷酸序列同源性为96％，由此所推导的氨基酸序列的同源性为97.5％。大白鼠tPAcDNA编码区(含信号肽)与文献发表的大白鼠tPAcDNA编码区的核苷酸序列，除2个碱基不同外，其余完全相同，与发表的人tPAcDNA编码区的核苷酸序列同源性约为80％(不含信号肽)，由此所推导的氨基酸序列的同源性为83％。本实验所用的人tPAcDNA由本室提供，是经基因突变改造过的第二代人tPA基因。将恒河猴、大白鼠、人tPAcDNA克隆于真核表达载体，转染CHO细胞后表达出了有活性的tPA。培养上清检测结果显示人tPA在CHO细胞中表达产物的活性最高，恒河猴和大白鼠tPA的活性明显低于人tPA的活性。将这三种tPA基因分别克隆于原核表达载体，结果表明原核表达产物几乎没有活性。 一个合适的表达筛选系统是DNA改组成功的关键。由于tPA只能在真核细胞中表达才有活性，所以DNA改组后的筛选只能建立在真核表达的基础上，这就意味着需要完成大量的探索性工作。本研究探索了DNA改组后的筛选途径，建立了大规模tPA活性筛选检测的方法。1.筛选途径：就是建立在真核表达系统的基础上，通过对单个细胞的克隆分离，实现筛选的第一步。真核表达中单个细胞克隆的获得比原核表达中单菌落的获得其难度和工作量要大得多。我们采用了稀释细胞，96孔板克隆的方法，从中摸索出了一些可行的经验和方法。2.筛选检测方法：大规模筛选的检测方法也是DNA改组的关键。DNA改组后的筛选检测方法不同于其他一些表达产物的检测可用简便的免疫学检测方法，改组后的筛选必须要检测表达产物的生物学活性，而且是大规模的检测。传统的tPA活性检测方法是琼脂平板法。该方法一次只能做几份至几十份的样品，无法适用于改组后一次完成几千至几万份样品的检测。我们将此方法进行了改良，建立了适用于tPADNA改组后大样品量检测的筛选方法。 在上述的基础工作准备完成后，我们以人tPAcDNA、恒河猴及大白鼠tPAcDNA为一组基因进行了tPA的改组(DNAfamilyshuffling)和筛选。筛选的结果和原先的设想有较大的距离，经过近20批次的改组和筛选，我们没有筛选到活性明显高于人tPA(经TNK优化改构过)的克隆。我们只得到了两株活性略高于人tPA的克隆，经RT-PCR、克隆、测序，证明为改组后的基因。再次转染CHO细胞、96孔板克隆，挑选表达量最高的克隆，扩大培养后收获上清、测其含量。与同样获得的人tPA表达上清比较它们之间的活性。结果显示两株克隆的活性分别高于人的4倍和2倍。这一结果和其他一些蛋白活性物质改组后活性提高几千至几万倍相距甚远，也未达到我们设想的提高几十至几百的目标。虽然这是一项探索性的工作，而且只是第一轮改组的结果，但是最终获得这一筛选结果仍不能令人满意。导致这一结果的原因可能是：1.tPA的结构比较复杂，有多个二硫键，改组后易影响tPA的折叠，引起活性的降低。2.改组后基于真核细胞表达系统的筛选相对原核表达系统的筛选而言效率太低，其中包括真核细胞的转染效率和一次筛选的克隆数都远不及原核。3.一个真核细胞可同时转染进几种不同的基因，而且一个基因表达量的高低又与其整合的位置有关，所以给筛选工作带来了较大的困难，无法有效地从多样性基因库中筛选到高活性的基因。 筛选到的这两株克隆序列测定结果表明，它们的序列以人和猴tPA的序列为主。和人tPA氨基酸序列(TNK)比较，其中一株克隆有16个氨基酸的差别，另一株有15个氨基酸的差别，有趣的是这一克隆有一88个氨基酸片段的缺失。在这些变异中，多数的变异序列来源于恒河猴，个别变异来源于大白鼠tPA。同样和恒河猴tPA氨基酸序列相比，多数的变异序列来源于人，个别变异来源于大白鼠tPA。 此外，本研究还尝试了对人tPA进行进一步的改造。在原有第117位Asn突变成Gln的基础上又将人tPA的第184，448的Asn突变成Gln，构建了含117、184二个突变点和含117、184、448三个突变点的两种突变体。文献报道此改造能提高tPA的活性，我们得到的结果表明这二个糖基化位点和三个糖基化位点的同时消除并不影响tPA的活性，但是也未观察到活性有所提高。针对tPA在体内的半衰期短这一问题，又将人IgG1Fc段基因与人tPA基因相连接，在CHO细胞中表达融合型的tPA，期望融合型的tPA能够延长其在体内的半衰期。但是结果显示，融合人Fc段的tPA其活性基本丧失。 一组基因经过第一轮DNA改组后不一定就能获得活性非常高的克隆，往往要以前一轮改组后获得的活性略高的几个克隆为基础进行下一轮的改组，一般需经过几轮DNA改组才能获得比较理想的结果。上述tPA改组的探索性研究结果将为今后真核表达系统DNA改组研究打下了基础，并提供有益的经验。