炎症性肠病（Inflammatory bowel disease,IBD）包括溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis,UC）和克罗恩病（Crohn’s disease,CD）。IBD患者常常表现为腹泻、黏液脓血便及腹痛等临床特征。由于IBD发病机制尚不十分清楚,目前普遍认为IBD是由于肠黏膜屏障功能受损,肠道内有害病菌侵入组织,进而引起人体免疫持续激活而导致的一类非特异性炎性疾病。IBD致病因素复杂,通常是由外部环境、遗传易感性和免疫反应等因素共同作用的结果。由于IBD具有迁延不愈和反复发作等特征,可严重影响患者的生活质量和精神状态,同时也给临床治疗带来极大的挑战,因此,进一步探讨和阐明IBD的发病机制尤为重要,进而为后续寻找新的有效治疗方法奠定理论基础。尽管IBD的发病机制尚未十分明确,但无论UC还是CD都存在着明确的肠黏膜屏障功能障碍,进而启动肠道免疫反应,而肠道免疫反应在IBD发病中发挥着重要作用。人体肠道黏膜结构复杂,对外界有害病菌入侵到人体内部组织发挥着重要的防御作用。专注于人类基因组的国际合作研究小组发现约30%的IBD相关基因位点与肠黏膜屏障有直接关系。而出现功能障碍的肠道黏膜会增加肠道通透性,加速对肠道内有害物质的暴露,进而持久激活肠道免疫系统,最终导致了IBD的发生发展。IBD患者的肠道黏膜存在许多特殊成分的改变或丢失,这些肠道屏障的受损程度和肠道黏膜组织的化学组成以及细胞膜的通透性等直接相关。而且在临床实践中也同样发现肠黏膜屏障与IBD的发病及严重程度密切相关。在IBD患者糖吸收测试过程中,应用共聚焦激光内窥镜成像技术可清楚的观察到不同患者肠黏膜屏障的受损程度,且肠道屏障完整程度与疾病活动程度密切相关。肠黏膜屏障主要包括物理屏障、免疫屏障和生物屏障。物理屏障由肠道上皮细胞、肠道黏膜等组成;免疫屏障包括肠道在内的整个免疫系统,主要由分泌性免疫蛋白组成;生物屏障主要是肠道内生物群落的保护作用。其中多种肠道黏膜上皮细胞表层蛋白,比如Occludin、ZO-1、Claudin-1等很大程度上决定了细胞的通透性和存活率等,直接关系到IBD的发生和发展。而当肠道黏膜出现结构和功能损伤时,抗肿瘤坏死因子-α（anti-TNF-α）治疗可减轻IBD患者的黏膜炎症并能够在一定程度上恢复肠道通透性。此外,一些营养素（如丁酸盐和锌）和肠道微生态制剂（如益生菌和益生元）也可改善肠黏膜屏障功能障碍。综上所述,肠黏膜屏障在IBD发病及治疗过程中的作用是至关重要的。CD4+T细胞是肠道免疫的屏障系统中最重要的效能细胞,而作为CD4+T细胞的一种亚群,Th9细胞主要通过分泌白介素-9（Interleukin-9,IL-9）发挥促炎作用。IL-9参与了人体各个组织器官的自身免疫性疾病的发生,研究发现,UC患者血清和肠组织中IL-9表达水平明显高于正常对照组,说明Th9细胞与IL-9在UC的发病中发挥着非常重要的作用。TNF-like ligand 1A（TL1A）是新近发现的一种肿瘤坏死因子家族新成员,主要为激活T淋巴细胞提供刺激信号,进而在IBD的发生发展中发挥重要作用,且肿瘤坏死因子超家族15（TNFSF15）是IBD的易感基因。研究显示,在过敏性肺炎小鼠模型中TL1A可促进Th9细胞分化和IL-9的生成。但是,TL1A是否通过Th9细胞及其分泌的IL-9调控肠道炎症尚不清楚。此外,TL1A的过表达是否对促进了IBD患者肠道屏障功能的改变,进而加速IBD的发生和发展亦无研究证实。因此,本研究采用淋系过表达TL1A的转基因小鼠及具有相同遗传背景的野生型小鼠为研究对象,建立DSS诱导的慢性实验性结肠炎模型。在此基础上研究TL1A对实验性结肠炎小鼠肠道屏障功能的影响。实验性结肠炎小鼠造模成功后给予小鼠腹腔注射IL-9抗体,通过观察结肠形态特征、肠道黏膜上皮细胞相关蛋白和细菌群落的变化,研究IL-9抗体在实验性结肠炎小鼠肠黏膜屏障中的作用,同时应用Caco-2单层细胞构建黏膜屏障,在细胞水平研究IL-9抗体对黏膜屏障的作用及机理;为未来IBD的治疗提供新的理论依据。本实验具体分为以下三部分:第一部分TL1A对实验性结肠炎小鼠肠黏膜屏障和Th9细胞分化的影响目的:探讨TL1A对实验性结肠炎小鼠肠道屏障功能的破坏作用。方法:应用淋系过表达TL1A的转基因小鼠与具有相同遗传背景的C57BL/6野生型小鼠通过饮用葡聚糖硫酸钠（Dextran sodium sulfate,DSS）建立慢性结肠炎小鼠模型,将转基因（Transgenic,Tg）小鼠和野生型小鼠随机分成四组,每组10只,分别命名为1)Con/WT组;2)DSS/WT组;3)Con/Tg组;4)DSS/Tg组。实验过程中,将DSS组（DSS/WT和DSS/Tg组）小鼠分别于第1～5天、8～12天、15～19天和22～26天饮用2.5%的DSS,其他时间饮用蒸馏水,共4个循环,每个循环的第1、3、5天进行DAI评分。第29天处死小鼠,采集肠组织、肠系膜淋巴结等标本。在实验过程中记录小鼠的体重及其疾病活动指数（Disease Activity Index）。测量小鼠的结肠长度。HE染色评估小鼠肠黏膜组织学变化,免疫荧光观察小鼠结肠紧密连接蛋白的表达,细菌培养观察腹腔淋巴结细菌移位情况,使用EUB338分析法测试细菌在肠道黏膜的分布情况。结果:1.成功建立慢性实验性结肠炎小鼠模型后,Con组（Con/Tg和Con/WT组）小鼠体重略有增加。但是,与Con组相比,DSS组（DSS/Tg和DSS/WT组）小鼠体重下降明显。与DSS/WT组小鼠相比,DSS/Tg组小鼠的体重进一步下降。2.DAI评分包括小鼠体重和粪便状态变化以及粪便潜血情况。结果显示:与Con/Tg和Con/WT相比,DSS/Tg和DSS/WT组DAI评分先增加,此后逐渐降低。同时,DSS/Tg组的DAI评分明显高于DSS/WT组,并且在第12、15、17、19、22、24天时具有统计学意义（P<0.05）。3.与Con组（Con/WT和Con/Tg）相比,DSS组（DSS/WT和DSS/Tg）小鼠结肠黏膜充血、水肿和肠壁增厚。DSS组结肠长度明显短于对照组（P<0.05）。DSS/Tg组小鼠的结肠长度（5.7±0.26 cm）明显短于Con/Tg组（7.9±0.31 cm）（P<0.05）。DSS/WT组的结肠长度明显短于Con/WT组（P<0.05）。此外,DSS/Tg组的结肠长度较DSS/WT组进一步缩短（P<0.05）。4.结肠组织HE染色结果表明,Con/WT组小鼠在光学显微镜下显示出完整的结肠黏膜上皮,并且腺体结构排列规则。DSS/WT组结肠出现肠黏膜缺损,杯状细胞明显减少,腺体结构破坏或消失,肠黏膜层、黏膜下层甚至肌层可见大量淋巴细胞浸润。DSS/WT组组织学评分明显高于Con/WT组（8.25±0.50和0.00±0.00）（P<0.01）。DSS/Tg组的损伤变化与DSS/WT组相似。DSS/Tg和Con/Tg组的组织病理学评分分别为12.50±0.58和0.00±0.00（P<0.01）。DSS/Tg组的病理组织学评分较DSS/WT组进一步升高（P<0.05）。5.DSS/WT组小鼠肠系膜淋巴结匀浆液细菌培养菌落显着高于Con/WT组（69.28±7.15colonies vs 1.86±0.14colonies,P<0.05）。DSS/Tg组的细菌菌落数显着高于Con/Tg组（187.56±5.14 colonies vs 2.60±0.53colonies,P<0.05）。DSS/Tg组的细菌菌落数明显高于DSS/WT组（187.56±5.14colonies vs 69.28±7.15colonies,P<0.05）。6.使用EUB338分析法测试细菌在肠道黏膜中的分布,计算绿色荧光部分的平均光密度,与Con/WT组相比,DSS/WT组的平均光密度值显著升高（1.26±0.10 vs 0.06±0.01,P<0.05）,同样,与Con/Tg组比较,DSS/Tg组的平均光密度值也显著升高（1.60±0.15 vs 0.10±0.02,P<0.05）,肠道黏膜细菌分布明显紊乱。此外,DSS组出现细菌团块,说明DSS/WT组和DSS/Tg组细菌明显移位,并且DSS/Tg组较DSS/WT组细菌移位更明显（1.60±0.15 vs 1.26±0.10,P<0.05）。7.与Con/WT组小鼠相比,DSS/WT组小鼠结肠组织中Occludin和Claudin-1表达阳性区域的平均光密度值明显降低,分别为（45.68±0.80 vs99.54±1.50,P<0.05）和（41.36±0.8 vs 86.86±0.75,P<0.05）;同样,与Con/Tg组小鼠相比,DSS/Tg组小鼠结肠组织中Occludin和Claudin-1表达的阳性区域的平均光密度值也明显降低,分别为（40.36±0.90 vs 90.86±1.60,P<0.05）和（35.45±0.75 vs 78.89±0.99,P<0.05）;DSS/Tg组小鼠结肠组织中Occludin和Claudin-1表达的阳性区域的平均光密度值较DSS/WT组小鼠明显降低,分别为（40.36±0.90 vs 45.68±0.80,P<0.05）和（35.45±0.75 vs41.36±0.8,P<0.05）。8.与Con/WT组小鼠相比,DSS/WT组小鼠结肠组织中CD4+IL-9+平均光密度值显著升高（0.25±0.03 vs 0.09±0.02,P<0.05）;同样,与Con/Tg组小鼠相比,DSS/Tg组小鼠结肠组织中CD4+IL-9+平均光密度值也显著升高（0.45±0.03 vs 0.11±0.01,P<0.05）;与DSS/WT组小鼠相比,DSS/Tg组小鼠结肠组织中CD4+IL-9+平均光密度值更高（0.45±0.03 vs 0.25±0.03,P<0.05）。第二部分IL-9抗体对TL1A过表达实验性结肠炎小鼠肠黏膜屏障的保护作用目的:研究IL-9抗体对慢性实验性结肠炎小鼠肠黏膜屏障功能的保护作用。方法:采用淋巴细胞过表达TL1A的转基因（Tg）小鼠和具有相同遗传背景的C57BL/6野生型小鼠,通过饮用葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导建立慢性实验性结肠炎模型,建模成功后腹腔注射IL-9抗体。将小鼠随机分为六组,每组10只,分别为Con/WT组,Con/Tg组,DSS/WT组、DSS/Tg组、DSS/WT+IL9 Ab组和DSS/Tg+IL9 Ab组。Con组饮用蒸馏水,而DSS组和IL-9 Ab组小鼠在第1至5、8至12、15至19和22至26天给小鼠饮用含有2.5%DSS的蒸馏水,并在其他时间给予小鼠蒸馏水。IL-9 Ab组小鼠在第15天开始分别给予IL-9中和抗体,抗体剂量为100ug/只,隔日1次。记录小鼠体重,分别于每个循环的第1、3、5天进行DAI评分,第29天处死动物,采集肠组织、肠系膜淋巴结等标本,测量肠道长度,进行结肠HE染色,MPO测定了解肠道炎症情况,采用免疫荧光染色测定小鼠结肠组织Occludin、JAMA和Claudin-1、Claudin-2、Claudin-3蛋白的表达;小鼠肠系膜淋巴结匀浆液细菌培养检测细菌移位;FISH观察不同处理下的小鼠肠道黏膜上的细菌分布。结果:1.随着实验的进行,Con组小鼠的体重略有增加。但是DSS组的小鼠体重出现明显下降。与DSS/WT组相比,DSS/Tg组小鼠体重下降更明显。注射IL-9抗体之后,第21天开始,IL-9 Ab/WT组小鼠体重逐渐回升,IL-9 Ab/WT组小鼠体重回升幅度明显大于DSS/WT组小鼠。同样,IL-9 Ab/Tg组小鼠体重回升幅度明显大于DSS/Tg组小鼠。与IL-9 Ab/Tg组小鼠相比,IL-9 Ab/WT组小鼠体重回升幅度更大。实验第24天、26天体重变化差异具有统计学意义（P<0.05）。2.实验期间,综合每只小鼠体重、粪便性状和粪便潜血情况进行DAI评分。给予IL-9抗体治疗后,IL-9 Ab/WT组小鼠DAI评分较DSS/WT组小鼠明显下降;IL-9 Ab/Tg组小鼠DAI评分较DSS/Tg组小鼠明显下降。与IL-9 Ab/Tg组小鼠相比,IL-9 Ab/WT组的小鼠DAI评分的下降更为明显。实验的第22天、24天、26天的DAI评分变化差异具有统计学意义（P<0.05）。3.给予IL-9抗体治疗后,IL-9 Ab/WT组小鼠结肠黏膜充血、水肿、肠壁增厚情况明显缓解,结肠长度明显大于DSS/WT组小鼠（7.17 cm±0.15cm vs 6.2 cm±0.12 cm,P<0.05）;同样,IL-9 Ab/Tg组小鼠结肠黏膜充血、水肿、肠壁增厚情况明显缓解,结肠长度明显大于DSS/Tg组小鼠（6.53cm±0.18 cm vs 5.8 cm±0.11 cm,P<0.05）;同时,与IL-9 Ab/Tg组相比,IL-9Ab/WT组小鼠结肠长度更长（7.17 cm±0.15 cm vs 6.53 cm±0.18 cm,P<0.05）。4.小鼠注射IL-9抗体后,IL-9 Ab/WT组小鼠结肠炎细胞浸润明显减少,结构破坏减轻,黏膜得到修复,病理评分明显低于DSS/WT组小鼠（3.8±0.8 vs 11.00±0.6,P<0.01）;同样,IL-9 Ab/Tg组小鼠结肠组织病理评分明显低于DSS/Tg组小鼠（6.2±0.7 vs 13.5±0.9,P<0.01）;同时,与IL-9 Ab/Tg组相比,IL-9 Ab/WT组小鼠病理评分更低（3.8±0.8 vs 6.2±0.7,P<0.01）。5.给予IL-9抗体注射后,IL-9 Ab/WT组小鼠结肠组织MPO活性与DSS/WT组小鼠相比明显下降（0.15±0.02 vs 0.95±0.12,P<0.05）;同样,IL-9Ab/Tg组小鼠结肠组织MPO活性与DSS/Tg组小鼠相比明显下降（0.45±0.07 vs 1.95±0.12,P<0.05）;同时,与IL-9 Ab/Tg组相比,IL-9 Ab/WT组小鼠结肠组织MPO活性更低（0.15±0.02 vs 0.45±0.07,P<0.05）。6.DSS组小鼠MLN匀浆液细菌培养菌落显著高于Con组小鼠,但是注射IL-9抗体之后,小鼠MLN匀浆液细菌菌落数量显著下降。与DSS/WT组相比,IL-9 Ab/WT组细菌菌落数明显减少（15.34±2.45colonies vs170.26±10.45colonies,P<0.05）,同样,与DSS/Tg组相比,IL-9 Ab/Tg组细菌菌落数明显减少（35.32±1.92colonies vs 265.47±12.11colonies,P<0.05）;同时,IL-9 Ab/WT组细菌菌落数较IL-9 Ab/Tg组明显减少（15.34±2.45colonies vs 35.32±1.92colonies,P<0.05）7.与Con组相比,DSS组肠道黏膜细菌分布明显紊乱,且细菌FISH出现了成簇。但是,在注射IL9抗体之后,细菌团块逐渐消失,细菌分布状态逐渐恢复。计算绿色荧光部分的平均光密度,与DSS/WT组相比,IL-9Ab/WT组的平均光密度值显著降低（0.40±0.08 vs 1.37±0.10,P<0.05）,同样,与DSS/Tg组相比,IL-9 Ab/Tg组的平均光密度值也显著降低（0.60±0.07vs 1.64±0.13,P<0.05）;同时,IL-9 Ab/WT组平均光密度值较IL-9 Ab/Tg组明显降低（0.40±0.08 vs 0.60±0.07,P<0.05）。8.注射IL-9抗体之后,相比较DSS组小鼠,DSS+IL9 Ab组小鼠的Occludin、JAMA和Claudin-1、Claudin-3的表达水平上升明显,但是Claudin-2的表达显著下调。第三部分IL-9抗体对Caco-2细胞肠屏障的保护作用与机制目的:在细胞水平上探讨IL-9抗体对肠黏膜屏障功能的保护作用及其机制。方法:采用Caco-2细胞模拟小鼠肠上皮细胞,将Caco-2细胞与CD4Na（?）ve T细胞共培养,分为四组:Caco-2组、Caco-2+TGF-β+IL-4组、Caco-2+TGF-β+IL-4+anti-IL-9组,Caco-2+TGF-β+IL-4+TL1A组。Caco-2组为单一Caco2细胞常规培养,Caco-2+TGF-β+IL-4组为CD4 Na（?）ve T细胞和Caco-2细胞共培养,CD4 Na（?）ve T细胞和Caco-2细胞按照效靶比50:1加入,同时加入终浓度为20pg/ml TGF-β,和10pg/ml IL-4刺激,模拟其分化为Th9。Caco-2+TGF-β+IL-4+anti-IL-9组为CD4 Na（?）ve T细胞和Caco-2细胞共培养加入TGF-β、IL-4刺激,同时加入终浓度为20pg/ml的抗IL-9抗体干预,Caco-2+TGF-β+IL-4+TL1A组为CD4 Na（?）ve T细胞和Caco-2细胞共培养加入TGF-β、IL-4后还加入浓度为10pg/ml的TL1A干预。将细胞培养48 h,采用光镜观察不同处理下的细胞形态的改变:采用单层上皮电阻法测定单层Caco-2细胞通透性的变化;Western-Blot测量Caco-2细胞中Occludin、ZO-1和Claudin-1的表达水平;酶联免疫吸附法（ELISA）检测上清液中IL-9的分泌;流式细胞术检测CD4+IL-9+细胞比例。结果:1.在细胞培养48h后,相比于Caco-2组,Caco-2+TGF-β+IL-4组和Caco-2+TGF-β+IL-4+TL1A组Occludin,Zo-1和Claudin-1的表达水平均明显降低（P<0.05）,并且Caco-2+TGF-β+IL-4+TL1A组比Caco-2+TGF-β+IL-4组更低（P<0.05）;而与Caco-2+TGF-β+IL-4+TL1A组和Caco-2+TGF-β+IL-4组相比,Caco-2+TGF-β+IL-4+anti IL-9组的Occludin、Zo-1和Claudin-1表达水平明显升高（P<0.05）。2.在细胞水平使用TEER评估IL-9抗体对Caco-2单层细胞通透性的影响;随着时间的推移,Caco-2组和Caco-2+TGF-β+IL-4+anti IL-9组的TEER值无明显变化,两组之间也未见明显变化。但与Caco-2组相比,Caco-2+TGF-β+IL-4组和Caco-2+TGF-β+IL-4+TL1A组的TEER值随着时间的推移明显降低（P<0.05）,且Caco-2+TGF-β+IL-4+TL1A组比Caco-2+TGF-β+IL-4组降低更明显（P<0.05）;与Caco-2+TGF-β+IL-4组相比,Caco-2+TGF-β+IL-4+anti IL-9组的12h、24h、48h TEER值均明显升高（P<0.05）。3.Caco-2组和Caco-2+TGF-β+IL-4+anti IL-9组细胞在48h内细胞凋亡率较低,细胞存活率均>90%。其中Caco-2+TGF-β+IL-4+anti IL-9组在12h、24h、48h的细胞存活率分别为（96.12±1.20）%、（96.20±1.10）%、（93.52±1.41）%;Caco-2+TGF-β+IL-4组在12h、24h、48h的细胞存活率分别为（93.52±3.10）%、（90.32±2.85）%、（86.22±2.10）%;Caco-2+TGF-β+IL-4+TL1A组在12h、24h、48h的细胞存活率分别为（86.22±2.10）%、（78.21±1.52）%、（48.52±3.10）%;与Caco-2+TGF-β+IL-4组相比,Caco-2+TGF-β+IL-4+TL1A组的细胞存活率明显降低（P<0.05）,Caco-2+TGF-β+IL-4+anti IL-9组的细胞存活率明显升高（P<0.05）。4.CCK8检测Caco-2细胞活力,Caco-2+TGF-β+IL-4组和Caco-2+TGF-β+IL-4+TL1A组的Caco-2细胞活力相比Caco-2组显著下调,随着时间的延长,细胞活性下调呈依赖性,相比Caco-2组具有显著性差异（P<0.05）,且在24h时Caco-2+TGF-β+IL-4+TL1A组较Caco-2+TGF-β+IL-4组明显降低（P<0.05）。随着时间的推移,Caco-2+TGF-β+IL-4+anti IL-9组在12h、24h、48h细胞活性较Caco-2+TGF-β+IL-4组及Caco-2+TGF-β+IL-4+TL1A组均明显升高（P<0.05）。5.培养48h后,光镜下观察发现Caco-2组和Caco-2+TGF-β+IL-4+anti IL-9组细胞形态正常,呈单细胞层紧密连接状,而Caco-2+TGF-β+IL-4组和Caco-2+TGF-β+IL-4+TL1A组细胞呈固缩状,形态显著改变,单层细胞结构改变。6.通过流式细胞术检测Th9（CD4+IL9+）细胞的比例。Caco-2+TGF-β+IL-4+TL1A组的Th9比例高于Caco-2+TGF-β+IL-4组,在48h时有明显统计学差异（48.04±1.9 vs 40.86±1.2,P<0.05）;与Caco-2+TGF-β+IL-4组相比,用IL-9抗体预处理的Caco-2+TGF-β+IL-4+anti IL-9组,在12h（8.70±1.3 vs 28.31±1.5）、24h（12.46±1.31 vs 31.22±1.6）和48h（15.45±1.32 vs 40.86±1.2）时,Th9细胞的比例均明显降低（P<0.05）。7.酶联免疫吸附法（ELISA）检测上清液中IL-9的分泌:Caco-2组及Caco-2+TGF-β+IL-4+anti IL-9组培养基中IL-9的分泌水平随着时间延长无显著性变化。Caco-2+TGF-β+IL-4组和Caco-2+TGF-β+IL-4+TL1A组培养基中IL-9的分泌水平随着时间延长显著上调,且Caco-2+TGF-β+IL-4+TL1A组较Caco-2+TGF-β+IL-4组上清液中IL-9的分泌明显升高（P<0.05）,而Caco-2+TGF-β+IL-4+anti IL-9组较Caco-2+TGF-β+IL-4+TL1A组明显降低（P<0.05）。结论:1.成功构建了DSS诱导的慢性实验性结肠炎模型;TL1A过表达加剧慢性实验性结肠炎小鼠肠道炎症,与其降低紧密连接蛋白Occludin和Claudin-1表达,破坏肠黏膜物理屏障,促进细菌移位破坏菌群屏障有关;TL1A可能通过促进肠组织中Th9细胞分化及IL-9的表达破坏肠黏膜屏障功能。2.DSS诱导的慢性实验性结肠炎小鼠中,肠系膜淋巴结细菌移位更明显,肠黏膜屏障功能破坏严重,而IL-9抗体可能通过中和IL-9来改善肠道上皮黏膜的通透性和恢复肠黏膜屏障功能,进而减轻实验性结肠炎小鼠的肠道炎症。3.IL-9抗体降低了Caco-2细胞凋亡率,提高了细胞存活率和细胞活性,其通过抑制Th9细胞分化、下调IL-9水平,促进Caco-2细胞的Occludin、Zo-1和Claudin-1的表达,并且IL-9抗体明显改变了细胞层的形态,减少了细胞固缩状态,使单细胞层呈现紧密连接的状态,提示IL-9抗体对肠黏膜上皮屏障具有保护作用。