一、背景与目的斑马鱼及新生乳鼠心脏再生能力的发现给再生医学领域提供了重要的研究模型及方法。谱系追踪技术于再生领域的应用证实,斑马鱼及新生乳鼠心脏损伤后再生的心肌细胞均主要来源于损伤区尚存心肌细胞的去分化及增殖。成人等成年哺乳动物心肌细胞多已退出细胞周期,自然状态下无法发生去分化及增殖,这可能就是其心脏再生能力十分有限的原因。因此明确心肌细胞去分化及增殖的病理生理机制成为自然心脏再生研究的关键所在。Gemberling等人研究表明神经调节蛋白1(Neuregulin1,Nrg1)是种强力的促心肌细胞分裂因子,即使没有心脏损伤也可以激活斑马鱼心脏再生进程。并且在未受损伤心室中他们也检测到erbb2(erb-b2 receptor tyrosine kinase 2)及erbb4b(erb-b2 receptor tyrosine kinase 4)在m RNA水平的表达,进而发现通过化学抑制剂阻断Erbb2受体可以抑制斑马鱼心脏再生时的心肌细胞增殖。Bersell等人对小鼠的研究发现,Nrg1可以通过促进细胞周期重启而促进成鼠心脏再生及心梗后心功能恢复,而Erb B4是Nrg1诱导心肌细胞周期重启必不可少的受体。该研究还发现Nrg1可以刺激单核心肌细胞增殖,但对多核细胞作用明显减弱。而单核心肌细胞正是斑马鱼及新生7日(7days postnatal,P7)内小鼠的主要心肌细胞类型。新生小鼠在P7后失去心脏再生能力,这与心肌细胞退出细胞周期的时间窗吻合。有趣的是,近期也有研究表明乳鼠出生后Erb B2受体表达显著降低,而此时Nrg1诱导的心肌细胞增殖作用也明显下降,提示Erb B2受体的减少可能是成年哺乳动物心肌细胞对Nrg1反应性下降的一个原因。Nrg1是一种细胞外生长因子,其受体为具有跨膜结构的酪氨酸激酶家族,包括Erb B1,2,3,4。Erb B受体在Nrg1的诱导下可以形成二聚体,激活胞内区域磷酸化而发挥活性作用。Erb B4是该家族受体中唯一既能与Nrg1直接结合又可发挥其酪氨酸激酶活性的受体,而Erb B2是一种共受体,并不能直接与Nrg1结合。另外,由于Erb B4在紧挨跨膜片段的膜外部分存在相对较长的“茎秆样”(stalk)结构,在与Nrg1结合后,Erb B4可从该处发生蛋白水解断裂,形成释放入细胞外的120KDa的胞外部分以及80KDa的胞内部分,该水解过程需要肿瘤坏死因子α转化酶(Tumor Necrosis factor-α-converting enzyme,TACE)的参与。80KDa的胞内部分在另一种膜蛋白γ分泌酶的作用下进一步水解断裂而从细胞膜释放入胞内成为Erb B4-ICD(intracellular domain),进而可转入细胞核内作为一种转录因子参与细胞周期的调控。虽然目前Nrg1/Erb B信号通路对心脏再生的作用已经得以明确,但对Nrg1重启细胞周期的作用机制尚不清楚,其关键的直接受体Erbb4参与细胞周期重启并调控心脏再生的具体作用机制尚不明确。因此,研究Erbb4受体在心脏中的表达模式对于其机制探索十分重要。本研究将通过对比可自然再生的模式生物与不可再生的成年哺乳动物心室中Erbb4的表达差异,结合Nrg1刺激作用下Erbb4受体的表达变化,为探索Erbb4重启细胞周期的作用机制提供重要的数据资料。二、研究方法(一)斑马鱼及小鼠实验操作选用6-8个月龄的AB野生型斑马鱼用于成年斑马鱼实验。本研究使用的已发表的转基因鱼系有fli1α1:EGFP,wt1:EGFP,gata4:EGFP,cmlc2:Cre ER,β-act2:lox P-m TagBFP-STOP-lox P-Nrg1(β-act2:BSNrg1)。斑马鱼心尖切除术依据Poss发表的方法进行,分别于3dpa、7dpa及14dpa收集RNA、蛋白及组织学标本,并以未损伤心脏作为对照。小鼠实验选取ICR/CD-1型孕鼠及2月龄成鼠。将孕期15日的孕鼠饲养至分娩,分别收集P1、P4、P8及2月龄成鼠心脏组织蛋白。为诱导斑马鱼心肌细胞表达Nrg1,将cmlc2:Cre ER与β-act2:BSNrg1鱼系进行杂交,筛选出双重转基因鱼系。将4-OH-Tamoxifen(4-HT)稀释于丙二醇中,配制成浓度为10μmol的鱼水并同时处理40dpf的Tg(cmlc2:Cre ER;β-act2:BSNrg1及β-act2:BSNrg1)斑马鱼,间隔4-5日重复1次,再过4-5日后收集心脏。为实现化学方法抑制TACE活性,对成年野生型斑马鱼行心尖切除术,于2-3dpa使用金属蛋白酶抑制剂GM6001(浓度为10μM)的鱼水处理,并收集心脏组织蛋白进行检测。(二)实时定量聚合酶链反应(q RT-PCR)用TRIzol?以常规方法抽提uncut、3dpa及7dpa斑马鱼全心室RNA,用Super Script?III First-Strand synthesis试剂盒将RNA反转录为c DNA。采用Roche Light Cycler?480Real-Time PCR系统对erbb4进行定量PCR检测,采集循环值,单个时间点至少重复三次实验并以斑马鱼ef1α作为内参。使用的引物序列为ef1α:F-AGCTCGTTGGAGTCAAC,R-TGCGCTGACTTCCTTGGTG;erbb4a:F-GTTGTGCCGTCGAACAATAG,R-CTGGCACTGATCCTCCTGA;erbb4b:F-ACTCAACGTGTTTCGCACTG,R-GCTCTGCCTCCAATAGTTGC。收集斑马鱼及小鼠心脏,去除心室外多余组织,根据组织体积加入相应量的细胞膜裂解液Buffer A(10 m M HEPES,PH=7.5;10 m M KCl;1 m M EDTA;2 m M Mg Cl2,1%NP40),匀浆并于500g×5min离心,吸取上清即为细胞浆蛋白。复洗后剩余部分加入50μl细胞核裂解剂Buffer B(Buffer A基础上加500m M Na Cl及25%Glycerol),静置后12000g高速离心,上清即为核蛋白。(四)蛋白免疫印迹检测(Western Blot)采用Western Blot分别检测斑马鱼再生过程、新生乳鼠及成鼠的全蛋白、核浆分离蛋白中的Erb B4、Tropomyosin、GAPDH的表达。组织全蛋白标本的提取采用RIPA裂解液。各蛋白样品分别加入4×Sample Buffer及10×Reducing Buffer,配制成1×Sample Buffer。选用浓度为8%的预制凝胶,并使用iblot?转膜系统将蛋白转移至硝化纤维素膜,修剪后用Odyssey Blocking Buffer于室温下封闭1小时,4°C孵育一抗16小时。PBST洗涤3次,室温避光孵育荧光二抗1小时。PBST洗涤3次后使用Odyssey红外激光扫描成像系统检测条带信号。一抗浓度为:anti-Erb B4(1:1000),antiTropomyosin(1:1000),anti-GAPDH(1:1000)。二抗浓度为:anti-mouse(1:10000),anti-rabbit(1:10000)。(五)组织免疫荧光检测1.组织切片免疫荧光染色将斑马鱼心脏组织制作成石蜡切片,脱蜡后加热引导下于VECTOR抗原修复液中进行抗原修复,随后使用组织切片封闭液(5%山羊血清,2.5%的马血清及0.3%Triton X-100,稀释于TBST)室温下封闭45min。4°C下孵育一抗16小时,TBST洗涤3次,室温下孵育二抗1小时,DAPI复染后封片。使用Zeiss LSM710共聚焦显微镜对切片进行检测并摄图。一抗及浓度:anti-Erb B4(1:200),anti-EGFP(1:500),antiTropomyosin(1:200)。二抗及浓度:anti-rabbit(1:200),anti-mouse(1:200),antiChicken(1:500),所有的组织切片检测均依据研究员单盲实验进行设计。2.全心组织荧光染色收集麻醉处死的fli1α:EGFP斑马鱼心脏,清洗后4°C下于4%的PFA固定24h,并于Dent’s液(25ml H2O2,10ml DMSO,40ml Me OH)漂白24小时,随后Dent’s固定液(50ml DMSO,200ml Me OH)再次固定24小时。清洗后孵育一抗5天,洗去一抗并避光条件孵育二抗5天,洗去二抗并于BABB液(50ml benzyl alcohol,100ml benzyl benzoate)进行透明化处理后固定于1%琼脂糖凝胶于共聚焦显微镜下摄片。(三)心室组织细胞核、细胞浆蛋白分离3.心肌细胞爬片荧光染色将24孔板中的心肌细胞爬片于4%PFA/PBS中固定10分钟,打孔10分钟后以封闭液封闭30分钟,随后一抗4°C下孵育16小时。PBS洗净后室温下避光孵育二抗30分钟。DAPI复染后封片,以荧光显微镜摄片。一抗及浓度:anti-Erb B4(1:200)或anti-a-actinin(1:300)。二抗及浓度:488 anti-mouse(1:200)。(六)统计学分析Western Blot结果通过灰度测量软件得到计量资料,以平均数±标准差表示,单组实验数据重复3次及以上。两组独立样本进行t检验,多因素样本采用方差分析,以P<0.05作为显著性差异标准。三、研究结果(一)erbb4在斑马鱼心脏再生过程中的表达erbb4的m RNA检测结果以ef1a作为内参进行校正,结果显示,在未损伤的斑马鱼心脏中均有erbb4a及erbb4b的表达。以未损伤斑马鱼心脏为对照,erbb4a及erbb4b的表达在7dpa时均显著下调。(二)Erbb4在斑马鱼心脏再生过程中的表达Western Blot检测结果表明Erbb4在斑马鱼心脏中主要以约60KDa的截短蛋白(Erbb4-ICD)形式存在,180KDa的全长蛋白含量相对较低。为了检测Erbb4在空间分布,我们进行了免疫荧光染色,并进一步分离了核浆蛋白进行Western Blot检测。荧光检测结果显示Erbb4表达于全心范围而心肌细胞核区的表达丰度较高,并且在未损伤心脏及损伤心脏中均有表达。Western结果也显示,在斑马鱼未损伤的心脏或者再生的心脏中,截短的Erbb4蛋白都主要表达于细胞核中,细胞浆中可检测到全长蛋白及剩余的截短蛋白表达。斑马鱼未损伤心脏组织切片及全心扫描结果的免疫荧光共染色结果显示,心肌细胞、心脏血管内皮细胞及心外膜细胞均可检测到Erbb4受体的表达,并且在心肌细胞内的分布主要位于细胞核区。(三)Erb B4在新生乳鼠及成鼠心脏中的表达Western Blot检测结果表明,在小鼠心脏中,Erb B4同样主要以约60KDa的ICD与180KDa的全长蛋白两种形式存在,Erb B4-ICD的表达量显著高于全长蛋白。其中ICD主要分布在细胞核中,全长蛋白仅分布于细胞浆中。从P1到P8,这两种形式的蛋白表达量均呈下降趋势。与新生乳鼠相比,已退出细胞周期的成鼠心脏中Erb B4-ICD及全长蛋白均显著减少。(四)Nrg1诱导未成年斑马鱼心肌细胞核中Erbb4的表达乳鼠及成鼠的对比研究表明心脏中的Erb B4-ICD及全长蛋白在小鼠心脏晚期发育阶段逐渐减少。为探索斑马鱼心脏发育至成熟过程Erbb4的变化,我们对比了未成年斑马鱼与成年斑马鱼心脏中Erbb4的表达。组织石蜡切片荧光染色结果表明,未成年斑马鱼心肌细胞核中Erbb4的表达水平明显低于成年斑马鱼。为探索Nrg1对Erbb4受体表达的影响,我们通过4-HT处理Tg(cmlc2:Cre ER;β-act2:BSNrg1)而诱导40dpf的斑马鱼心肌细胞特异性表达Nrg1,并以Tg(β-act2:BSNrg1)作为对照组,对55dpf的心脏石蜡切片行Erbb4及Tropomyosin的免疫荧光染色。结果显示,Erbb4的心肌细胞核区染色明显强于对照组,这表明心肌细胞过表达Nrg1可以诱导斑马鱼心肌细胞核中Erbb4的表达。(五)斑马鱼心肌细胞核内ICD可能直接由erbb4翻译而来TACE是Erb B4蛋白水解所必要的一种金属蛋白酶,GM6001为基质金属蛋白酶抑制剂,可抑制TACE活性。对斑马鱼行心尖切除术后于2-3dpa予以10μM化学抑制剂GM6001处理,并提取心脏组织蛋白行的Western Blot检测结果显示,60KDa左右的Erbb4-ICD表达量未见显著改变。这提示细胞核中的Erbb4-ICD可能并非来自全长蛋白的水解。对斑马鱼erbb4开放阅读框的分析表明,erbb4除了可以翻译成180KDa的全长蛋白外,也可以直接翻译为大小约63KDa的碳-端蛋白,这与我们发现的60KDa左右的ICD分子量大小基本一致,说明核内的Erbb4-ICD可能由erbb4以替代起始位点直接翻译而成。四、结论(一)Erb B4在可自然再生的斑马鱼及新生乳鼠体内主要有Erbb4-ICD及全长蛋白两种形式,并分别存在于细胞核及细胞浆中。(二)在不具备再生能力的成鼠心脏中,Erb B4-ICD及全长蛋白在对应区域的表达显著降低。(三)未成年斑马鱼心肌细胞核内Erbb4的表达明显低于成年斑马鱼,心肌细胞特异性过表达Nrg1可诱导细胞核区的Erbb4表达显著增强。由于Erbb4全长蛋白并不分布于细胞核中,这表明Erbb4受Nrg1刺激后可能通过形式或位置的改变来参与细胞周期的调控。(四)抑制斑马鱼TACE活性,心室中Erb B4-ICD表达水平未见明显变化,说明细胞核中60KDa的ICD可能并非主要由全长蛋白水解而来。对斑马鱼erbb4开放阅框的分析对比表明,细胞核中的Erbb4-ICD可能由由erbb4以替代起始位点直接翻译而成。