赖氨酸巴豆酰化修饰(Lysine crotonylation,Kcr)是2011年鉴定到的一种新型酰化修饰,它参与精子形成过程中的逃逸性染色体关联基因沉默和组蛋白替换。然而成熟精子中是否存在Kcr及其功能如何尚未明确。精子细胞核内几乎不发生复制和转录过程,其生理功能主要受蛋白翻译后修饰调控。蛋白磷酸化在精子中广泛存在,是完成获能以及受精的基础。钙离子载体A23187可诱导精子完成受精作用,但A23187处理的精子中磷酸化并未被激活,精子生理功能的改变是否与Kcr有关,目前未见报道。本研究使用抗体富集和液相色谱质谱联用技术,对小鼠成熟精子中蛋白的Kcr进行鉴定,并利用生物信息学分析手段,蛋白免疫印记和免疫荧光等技术对未获能组,获能组以及A23187处理组精子中Kcr蛋白的功能进行深入探究。研究结果表明:1.小鼠精子形成过程中存在大量Kcr蛋白,包括组蛋白和非组蛋白。精子组蛋白上共鉴定到有28个Kcr位点,与小鼠胚胎成纤维细胞相比,成熟精子中组蛋白Kcr修饰位点向羧基端偏移,影响精子结构并参与维持细胞核的致密性。2.与已被报道的Hela细胞相比,成熟精子中Kcr蛋白分布和Motif位点具有较大差异。精子Kcr蛋白较少参与到DNA复制,基因表达和RNA剪切等过程,而在能量代谢与繁殖等过程中发挥重要作用,这与精子大部分细胞质被去除且不具备转录复制活性的特征相一致。3.精子中Kcr作为一种新的修饰能够参与调节获能,并受到钙离子的调控。钙离子可通过抑制去Kcr酶(histone deacetylases,HDACs)的活性而不是提高促Kcr酶(P300/CBP)的活性,促进精子中Kcr水平的增加。4.A23187处理组中钙离子提高精子糖酵解、乙酰辅酶A合成、三羧酸循环和氧化磷酸化途径中关键酶的Kcr水平,抑制线粒体膜电位和ATP生成,抑制磷酸化修饰,提示Kcr与能量代谢间存在直接关系。5.钙离子诱导精子中参与调控能量代谢、结构运动和抗逆性蛋白Kcr增加。能量代谢关键酶Kcr水平增加抑制能量生成;微管蛋白等结构蛋白Kcr水平上升进而降低精子结构运动性;谷胱甘肽硫转移酶等具有细胞保护作用的蛋白Kcr增加,其活性增强,维持精子存活的状态。以上揭示A23187引起精子运动性降低但存活的分子机制。本文揭示Kcr作为新的蛋白修饰参与到精子获能中,拓展了Kcr功能,为精子能量代谢、运动性相关疾病的治疗提供新的思路,也为哺乳动物精子中蛋白Kcr研究提供基础资料。