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目的:观察肾痿复方含药血清对TGF-β1诱导的大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E发生EMT和细胞外基质分泌的影响,探讨肾痿复方干预肾间质纤维化的作用机制,为临床应用提供细胞生物学证据。方法:1.含药血清制备:SD大鼠随机分为空白对照组和肾痿复方组,按成人的10倍剂量给予肾痿复方组大鼠中药灌胃,空白对照组给予同等体积生理盐水灌胃。2.肾痿复方含药血清对NRK-52E细胞生长的影响:体外培养的NRK-52E细胞分为正常对照组、空白血清组、含药血清干预组(高中低剂量)。倒置相差显微镜观察细胞生长状态,CCK8法检测各组细胞活性,观察含药血清对正常NRK-52E细胞生长有无影响。3.肾痿复方含药血清对TGF-β1诱导的NRK-52E细胞转分化、细胞外基质分泌及Smads蛋白表达的影响:体外培养的NRK-52E细胞分为6个组:正常对照组(5%胎牛血清)、空白血清组(5%正常大鼠血清)、TGF-β1刺激组(TGF-β1 10ng/ml+5%大鼠血清)、肾痿复方高剂量组(TGF-β1 10ng/ml+5%含药血清)、肾痿复方中剂量组(TGF-β1 10ng/ml+2.5%含药血清)、肾痿复方低剂量组(TGF-β1 10ng/ml+1.25%含药血清)。倒置相差显微镜观察细胞形态;Western Blot检测α-SMA、E-cadherin、Smad3、p-Smad3、Smad7蛋白含量;免疫荧光检测Fibronectin、Laminnin蛋白表达情况;Real-time PCR检测细胞α-SMA、E-cadherin的mRNA表达。结果:1.肾痿复方含药血清对NRK-52E细胞生长的影响:倒置相差显微镜下观察,空白大鼠血清和肾痿复方含药血清培养的NRK-52E细胞,具有典型上皮细胞的形态,椭圆形或多角形,排列规整,胞间紧密连接,呈“铺路石”样贴壁生长。CCK8细胞活力检测显示,大鼠空白血清和肾痿复方含药血清培养NRK-52E细胞72h,细胞稍有活力增加,两组见无明显差异。2.肾痿复方含药血清对NRK-52E细胞转分化的影响:(1)倒置相差显微镜下观察,TGF-β1刺激后大部分细胞出现长梭样改变。在肾痿复方干预后,可见NRK-52E细胞逐渐由长梭状变回椭圆形。(2)Western Blot结果显示,TGF-β1刺激组E-cadherin蛋白显著降低,α-SMA蛋白明显增加,与空白血清组比较,均有显著差异(P<0.01)。肾痿复方含药血清干预后,E-cadherin蛋白表达量逐渐增加至接近正常值,α-SMA蛋白表达量逐渐减低,与TGF-β1刺激组比较均有统计学差异(P<0.01),且两者均呈剂量依赖改变。(3)Real-time PCR结果显示,TGF-β1刺激后,E-cadherin mRNA表达显著降低,α-SMA mRNA表达明显增加,与空白血清组比较,均有显著差异(P<0.01)。加入肾痿复方含药血清干预后,E-cadherin mRNA表达量逐渐增加,α-SMA mRNA表达量逐渐减低,与TGF-β1刺激组比较均有统计学差异(P<0.01),且两者均呈剂量依赖改变。3.肾痿复方含药血清对NRK-52E细胞分泌Fibronectin和Laminin的影响:免疫荧光染色结果显示,与空白血清组比较,TGF-β1刺激后,Fibronectin和Laminin蛋白表达明显增加。加入肾痿复方含药血清干预后,Fibronectin和Laminin蛋白表达量逐渐减低。4.肾痿复方含药血清对NRK-52E细胞表达Smad3、p-Smad3、Smad7的影响:(1)各组Smad3总蛋白的表达未见明显差异。与空白血清组比较,TGF-β1刺激组的磷酸化的Smad3蛋白明显增加(P<0.01)。加入肾痿复方含药血清干预后,磷酸化的Smad3蛋白降低,与TGF-β1刺激组比较,虽然无统计学意义,但有逐渐减低、趋于正常的趋势。(2)与空白血清组比较,TGF-β1刺激后Smad7蛋白表达明显降低(P<0.01)。加入肾痿复方含药血清干预后,Smad7蛋白出现明显的回升的趋势,与TGF-β1刺激组比较,有统计学差异(P<0.01),且这种改变与肾痿复方含药血清剂量相关。结论:1.肾痿复方能够维持大鼠NRK-52E细胞的正常形态及生长,对NRK-52E细胞无毒性作用。2.肾痿复方能够抑制TGF-β1诱导的α-SMA蛋白以及细胞外基质Fibronectin、Laminin的表达。3.肾痿复方能恢复上皮细胞标志蛋白E-cadherin的降低,同时能够抑制TGF-β/Smad信号通路中Smad3的磷酸化,提高Smad7的表达,从而抑制EMT,起到抗肾小管间质纤维化的作用。