论文部分内容阅读
目的：NRP1作为一种非酪氨酸激酶受体，在胃癌的发生发展中有着重要的作用。而miRNA则是一种普遍存在于生物内的调控基因，和很多疾病，尤其是肿瘤，有着密切的关系。目前尚不知道调节NRP1的上游miRNA，因此本文的目的主要是找出NRP1的上游miRNA，并研究其在胃癌生长、增殖、凋亡及侵袭转移中的作用。方法：1.通过基因芯片技术及生物预测软件，预测出NRP1的上游miRNA。2.通过荧光定量PCR（qRT-PCR）法检测了该miRNA在5种胃癌细胞株(SGC7901, HGC27, AGS, MKN45及N87)和正常胃粘膜细胞株GES1中的表达，以及41例胃癌组织和24例癌旁组织中该miRNA的表达。3.构建野生型的NRP1PsicheckTM-2载体及定点突变后的NRP1PsicheckTM-2载体，并和miRNA mimics一起通过脂质体共转染，转染18小时后行双荧光素酶检验。4.构建该miRNA的慢病毒载体并将其感染至胃癌细胞株AGS及MKN45中，并通过MTT、平板克隆实验、transwell小室侵袭实验及流式细胞仪检测AGS及MKN45中生长、凋亡及侵袭转移能力；进行NPR1过表达补救实验，即构建缺少3’UTR端的NRP1过表达载体，将其与该miRNA分别转染至AGS细胞株中，把实验分为四种①对照组②NRP1过表达组③miRNA过表达组④miRNA过表达NRP1过表达组，分别检测其生长、凋亡及侵袭转移能力。5将过表达该miRNA的胃癌稳定细胞株AGS或过表达NRP1的胃癌稳定细胞株AGS注入裸鼠皮下，观察裸鼠胃癌移植瘤的生长情况。6.通过Western blot法检测过表达该miRNA后，磷酸化ERK1/2, Akt及P38MAPK表达水平的变化，并同样进行上述的补救实验。7.构建NRP1小干扰质粒SiNRP1，并通过Western blot检测NRP1干扰后AGS细胞中上皮细胞标志物（E-cadherin蛋白）和间叶细胞标志物（fibronectin, vimentin, N-cadherin和SNAIL蛋白）的表达情况；检测过表达该miRNA或NRP1后，AGS细胞中上皮和间叶细胞标志物的表达情况。结果：1.通过基因芯片技术及生物预测软件，预测出NRP1的上游miRNA为miR-338。2. qRT-PCR结果表明，miR-338在5种胃癌细胞株中的表达较正常胃粘膜细胞明显降低(p<0.05)，miR-338在41例胃癌组织中的表达也较24例癌旁组织明显降低(p<0.05)。3.双荧光素酶检验结果显示miR-338能明显抑制野生型NRP1PsicheckTM-2载体的荧光强度(p<0.05)，而无法抑制突变后NRP1PsicheckTM-2载体的荧光强度(p>0.05)，说明NRP1为miR-338的下游靶基因。4. MTT、平板克隆实验、transwell小室侵袭实验及流式细胞仪检测结果表明，过表达miR-338组中胃癌细胞株AGS及MKN45的生长、增殖及侵袭转移能力较对照组明显降低(p<0.05)，凋亡水平较对照组明显增加(p<0.05)；补救实验证明，过表达NRP1能恢复过表达miR-338胃癌细胞的生长、增殖、凋亡及侵袭转移能力，说明miR-338是通过抑制NRP1的表达来抑制胃癌生长的。5.过表达miR-338组中裸鼠胃癌移植瘤大小较对照组明显减少(p<0.05)；过表达NRP1及miR-338后的裸鼠胃癌移植瘤大小与对照组基本一致，说明miR-338是通过抑制NRP1的表达来抑制裸鼠移植瘤生长的。6. Western blot检测结果表明，过表达miR-338组中磷酸化ERK1/2, Akt及P38MAPK的表达较对照组明显减少(p<0.05)，补救实验证明，过表达NRP1能恢复过表达miR-338组中磷酸化ERK1/2,Akt及P38MAPK的表达水平，说明miR-338是通过抑制NRP1的表达来调节相关信号通路的。7. Western blot检测结果表明，NRP1干扰组E-cadherin蛋白表达较对照组明显增加(p<0.05)，fibronectin, vimentin, N-cadherin和SNAIL蛋白较对照组明显减少(p<0.05)，说明NRP1能调节胃癌的上皮间充质转化进程；过表达miR-338组中，E-cadherin蛋白表达较对照组明显增加(p<0.05)，fibronectin, vimentin, N-cadherin和SNAIL蛋白较对照组明显减少(p<0.05)，说明miR-338和siNRP1一样，可以抑制胃癌的上皮间充质转化进程；过表达NRP1能恢复过表达miR-338胃癌细胞中的上皮间叶细胞标志物，说明miR-338是通过NRP1来调节胃癌上皮间充质转化进程的。结论：miR-338作为一种抑癌基因，在胃癌中低表达。而过表达的miR-338可以通过抑制NRP1的表达，经ERK1/2,Akt及P38MAPK通路，来抑制胃癌的生长、增殖、侵袭转移及胃癌的上皮间充质转化。