目的1、本课题入选DM及DN患者设置临床试验,观察大黄对糖尿病肾病患者的一般情况、血脂、24小时蛋白尿、肾功能、C反应蛋白的影响情况,大黄对DN患者血清和尿液中TGF-β1、MMPs、及和尿MCP-1的表达情况,探讨其对DN发生发展的干预作用及分子机理研究的影响,一方面探索大黄对糖尿病肾病特异性指标TGF-β1、MMP-2、MMP-9,尿MCP-1的影响情况以阐明其治疗糖尿病肾病的分子机理,；另一方面归纳大黄对糖尿病肾病的临床疗效和可能机制,了解大黄治疗糖尿病肾病的可能多靶点,提高糖尿病肾病的临床疗效,使其更好的运用于临床,为其临床应用提供有效依据。2、体外实验研究：选择大黄素,观察其对病例组血液淋巴细胞标本MCP-1水平的影响情况,并证明大黄素是大黄中起主要治疗作用的成分。所以选择大黄素体外研究,观察其对糖尿病肾病的治疗效果。内容与方法1、临床研究：将60例DN患者进行随机分为ABC三组,A组给予基础治疗；B组在常规治疗的基础上加用阿托伐他汀,每日口服20mg；C组在基础治疗的基础上加用大黄粉,每日口服5g；分别用大黄治疗8周、16周、24周,并观察各组患者每个治疗周期的血脂、24小时蛋白尿、TGF-β1、MMP-2、MMP-9及MCP-1情况。1)比较DM患者与DN患者血脂、24小时蛋白尿、TGF-β1、MMP-2、MMP-9及尿MCP-1的差异。2)TGF-β1、MMP-9、及尿MCP-1的测定均采用ELISA法。3)比较DN患者治疗前后各实验室指标,归纳大黄对糖尿病肾病的治疗作用和治疗机制。2、实验研究：1)入选病例的血液及尿液标本,治疗前后TGF-β1、MMP-9及MCP-1的测定均采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)。往预先包被转化生长因子β1(TGF-β1)抗体、或MMP-9、MCP-1抗体的包被微孔中,依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体,经过温育并洗涤干净。用底物四甲基联苯胺显色,四甲基联苯胺在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的转化生长因子β1(TGF-β1)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),计算样品浓度。2)MMP-2活性的检测采用明胶SDS-PAGE酶谱法,MMP-2表达水平与活性的检测采用逆行追踪免疫吸附法。3)选择大黄素为研究物质,做糖尿病肾病外周血的体外实验,提取其淋巴细胞,并加入不同剂量大黄素进行体外培养。抽取DN患者l0ml静脉血,枸橼酸钠抗凝,磷酸缓冲液等量稀释,按Ficoll密度梯离心法(1500r/min转速,10分钟)将新鲜淋巴细胞提取出来,用0.2%台盼蓝染色计数活细胞使之大于95%。调整细胞密度]×106/ml,将样本分成4组,进行观察。结果1、2型糖尿病患者血脂异常是糖尿病肾病重要危险因素之一,本实验结果显示,大黄治疗24周后,患者CHOL下降为(1.63±0.28)mmol/L、TG从(5.23±0.69)mmol/L下降为(4.31±0.36)mmol/L,尿1β2微球蛋白下降为(5.22±2.96)mg/L,24小时蛋白尿(1.05±0.28)g/d,血Cr下降为(167.05±72.47)umol/L,均有统计学意义。2、大黄对DN患者血、尿TGF-β1(ng/ml)的影响结果显示A组与B、C组对比,8周无统计学意义(p>0.05),16周有统计学意义(p<0.05),24周有显著性统计学意义(p<0.01)。B组与C组比较16周无统计学意义(p<0.05),24周有统计学意义(p<0.01)。从趋势图中可以看出A组血中TGF-β1持续高表达,与大黄治疗组形成鲜明对比,说明了大黄的治疗作用,且随着治疗时间的延长,这种差异越明显。3、大黄对DN患者血、尿MMP-2(ng/m1)及MMP-9的影响结果显示A组与B、C组对比,8周无统计学意义(p>0.05),16周有统计学意义(p<0.05),24周有显著性统计学意义(p<0.01)。B组与C组比较16周无统计学意义(p<0.05),24周有统计学意义(p<0.01)。4、利用Fic01]密度梯离心法分离血巨噬细胞,大黄素对巨噬细胞中MCP-]水平的影响：10μ g/m1组(61.00±28.90)>50u g/m](41.00±18.90)>100u g/ml(21.00±6.90)。各组间有统计学差异,P<0.05。大黄对DN患者尿MCP-1(ug/L)的影响结果显示A组与B、C组对比,8周无统计学意义(p>0.05),16周有统计学意义(p<0.05),24周有显著性统计学意义(p<0.01)。B组与C组比较16周无统计学意义(p<0.05),24周有统计学意义(p<0.01)。结论1、DN组BMI及腰围均比DM组高,有显著性差异,而腰围正是反映内脏脂肪的有效指标,通过对糖尿病病人的临床特征研究提示对糖尿病患者的治疗不仅要以控制血糖为中心目标,而且要采取纠正血脂紊乱,调节血压,抗炎、保护肾脏功能等综合措施才能有效防止糖尿病肾病发生、发展。所以降脂治疗也可以降少DN病人的尿蛋白和炎症程度。脂质与炎症协调导致肾毒性。2、临床实验发现大黄能明显改善糖尿病患者一般身体情况,降低肾小球高滤过,减少蛋白尿,降低血脂,改善患者的肾功能。对照组TGF-β1持续高表达,治疗组随着用药时间的延长TGF-β1,表达逐渐减低,较对照组有显著统计学意义。提示在糖尿病肾病的发生和发展过程中TGF-β1起到重要作用,大黄能降低DN患者体内循环中TGF-β1的表达,说明其对DN患者具有肾脏保护作用。3、大黄下调了DN患者上升的MMP-2、MMP-9的表达水平,其主要通过作用于相关细胞因子的作用途径,糖尿病肾病的脂代谢紊乱,肾内血流动力学,肾脂质过氧化损伤得到改善,肾成纤维细胞增殖与凋亡得到调节等。在糖尿病肾病中,大黄纠正MMP-2、MMP-9表达和活性的异常,可以改善肾脏MMP/TIMP系统平衡紊乱,对于减少ECM积聚,延缓肾小球硬化具有重要意义。糖尿病肾病尿MCP-1水平是增高的,大黄治疗后DN患者尿MCP-1表达水平明显降低。4、体外试验表明：大黄素能抑制糖尿病肾病患者外周血MCP-1水平,且随着大黄素浓度增高,抑制效果越来越明显。大黄素下调MCP-1的表达可能是其治疗糖尿病肾病有效的重要环节。大黄素能抑制DN患者外周血MCP-1水平,且呈浓度依赖关系,说明大黄素是大黄治疗糖尿病肾病的主要有效成分。