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随着重组DNA技术的发展和表达体系的完善,已知的蛋白质数目有了很大增长。确定蛋白质结构的研究则纷纷提上日程,X射线衍射是确定蛋白质结构的最有效方法,而X射线结晶学的应用要求大分子晶体具有足够大的尺寸(大于0.1mm)和完美的质量,以获得精确的衍射数据。然而,许多生物大分子晶体常常难以成长,一般小分子结晶的方法都不适合于大分子的晶体生长。因此,获得质量完美的蛋白质晶体成为蛋白质结构测定的主要瓶颈,需要探索新的结晶方法以制备蛋白质等生物大分子晶体。用膜结晶技术结晶蛋白质可得到适合于衍射分析的大尺寸蛋白质晶体。
利用聚偏氟乙烯(PVDF)中空纤维膜对溶菌酶的静态膜结晶过程进行实验研究,考察了沉淀剂浓度、洗脱液浓度和结晶溶液蛋白质初始浓度对膜结晶过程的影响。结果表明:溶剂跨膜通量随沉淀剂浓度的减小而增大;较高的洗脱液浓度在实验开始阶段引起较高的溶剂跨膜通量,而实验过程中使溶剂跨膜通量下降较快;溶剂跨膜通量随溶菌酶初始浓度的增大而减小。结合溶菌酶晶体的尺寸分布和晶体的显微镜观察,获得最优操作条件为沉淀剂NaCl浓度为4%(w/v),洗脱液MgCl2浓度为20%(w/v),溶菌酶初始浓度为20mg/ml。
对溶菌酶的动态膜结晶过程进行了研究,考察了结晶溶液和洗脱液流速对膜结晶过程溶剂跨膜通量和总传质系数的影响。结果表明:各种操作条件下,溶剂跨膜通量和总传质系数都是随着实验的进行而不断减小,而且流速越大它们减小得就越快;流速较大时晶体尺寸小而数量多;流速较小时晶体数量少而尺寸较大,但容易出现损伤;动态膜结晶过程中,膜界面两侧的传质阻力处于相近的水平,且结晶溶液侧的阻力略大于洗脱液侧的传质阻力。
此外,本文还研究了牛血清白蛋白的静态膜结晶过程,考察了温度和初始膜面积对膜结晶过程的影响。结果表明:在实验的范围内,溶剂跨膜通量随初始膜面积的减小而增大;在低温下溶剂跨膜通量较小,结晶溶液诱导时间也较长;15℃下膜结晶所获得的牛血清白蛋白晶体形状固定,尺寸大且均匀,适于X射线衍射分析。