论文部分内容阅读
生长素调控着一系列的植物发育和生理活动进程,包括胚胎发育,维管的分化,器官的发生,向性生长以及根和茎的形态建成等。生长素结合蛋白(ABP1)是一种可以与生长素结合并介导一系列生理反应的蛋白质。
本文主要利用转基因技术,研究棉花生长素结合蛋白(GhABP1)中半胱氨酸利C端多肽对该基因在烟草中功能的影响;以及对GhABP1基因在纤维发育中的表达进行了初步的研究。主要结果如下:1.棉花生长素结合蛋白(GhABP1)的生物信息学分析GhABP1的cDNA序列全长630bp,共编码191个氦基酸。编码蛋白质的N端包含一个由24个氮基酸构成的信号肽。去除信号肽序列后,有三个极端保守的半胱氨酸,分别位于在3、63、157位置上。这三个半胱氨酸残基位于可能导致结构发生变化的敏感位置上。2.GhABP1住烟草中具有与AtABP1相同的功能:通过转基因手段,获得了超量表达GhABP1的转基因烟草植株。对其叶片条进行叶片组织向性生长实验,发现当外加10μm NAA处理后,曲率明显大于野生型植株——这是超量表达拟南芥来源的AtABP1的特征性反应之一。因此GhABP1在烟草中与拟南芥来源的AtABP1具有相同的功能。3.C端α序列对GhABP1功能的影响通过定点突变去除GhABP1 C端α螺旋序列,获得突变体GhABP1—NC,并获取相应的超量表达烟草植株。超量表达植株叶片条在组织向性生长实验中未观察到与超量表达野生型GhABP1相似的、在NAA处理后曲率增加的特征;同时也未观察到该超量表达植株的表型有任何明显变化。表明,GhABP1在去除了C端α螺旋序列后,其功能丧失,但却没有竞争正常ABP1的结合位。GhABP1的C端多肽可能是且是唯一的ABP1锚定和活性结构域。4.三个半胱氨酸对GhABP1功能的影响将GhABP1编码的三个保守半胱氨酸分别定点突变为丝氨酸后,各自在烟草中超量表达并进行叶片组织向性生长测试。经10μM NAA处理后,超量表达GhABP1—C3S以及GhABP1—C63S植株叶片条的曲率均明显高于野生型,即表现出超量表达正常GhABP1烟草植株的特征。超量表达GhABP1—C157S植株的反应与野生型植株基本一致。157位半胱氨酸的突变导致了GhABP1功能的丧失,3、63位半胱氨酸的突变则没有降低GhABP1住高浓度NAA下的活性。不外加10μM NAA处理的情况下,GhABP1—C63S超量表达植株叶片曲率也明显超过了同样条件下的野生型植株;而GhABP1-C3S超量表达植株叶片曲率则不高于与相同条件下野生型植株相似。因此,第三位半胱氨酸的突变没有影响GhABP1的功能;第63位半胱氨酸的突变则是GhABP1对生长素的敏感度增加。5.超量表达GhABP1—C63S对植株表型的影响已经证实了63位半胱氨酸的突变将导致GhABP1在不外加生长素时的高活性。在植株表型的分析中也发现,超量表达GhABP1—C63S植株出现了特殊的表型,如植株明显发育迟缓,叶片变小缺乏光泽等。6.棉花生长素结合蛋白基因的表达分析在纤维不同发育时期,通过Northern杂交分析发现,GhABP1在棉纤维发育的9—20天有较高的表达量。表明GhABP1基因有可能参与了棉纤维发育的进程。
本文主要利用转基因技术,研究棉花生长素结合蛋白(GhABP1)中半胱氨酸利C端多肽对该基因在烟草中功能的影响;以及对GhABP1基因在纤维发育中的表达进行了初步的研究。主要结果如下:1.棉花生长素结合蛋白(GhABP1)的生物信息学分析GhABP1的cDNA序列全长630bp,共编码191个氦基酸。编码蛋白质的N端包含一个由24个氮基酸构成的信号肽。去除信号肽序列后,有三个极端保守的半胱氨酸,分别位于在3、63、157位置上。这三个半胱氨酸残基位于可能导致结构发生变化的敏感位置上。2.GhABP1住烟草中具有与AtABP1相同的功能:通过转基因手段,获得了超量表达GhABP1的转基因烟草植株。对其叶片条进行叶片组织向性生长实验,发现当外加10μm NAA处理后,曲率明显大于野生型植株——这是超量表达拟南芥来源的AtABP1的特征性反应之一。因此GhABP1在烟草中与拟南芥来源的AtABP1具有相同的功能。3.C端α序列对GhABP1功能的影响通过定点突变去除GhABP1 C端α螺旋序列,获得突变体GhABP1—NC,并获取相应的超量表达烟草植株。超量表达植株叶片条在组织向性生长实验中未观察到与超量表达野生型GhABP1相似的、在NAA处理后曲率增加的特征;同时也未观察到该超量表达植株的表型有任何明显变化。表明,GhABP1在去除了C端α螺旋序列后,其功能丧失,但却没有竞争正常ABP1的结合位。GhABP1的C端多肽可能是且是唯一的ABP1锚定和活性结构域。4.三个半胱氨酸对GhABP1功能的影响将GhABP1编码的三个保守半胱氨酸分别定点突变为丝氨酸后,各自在烟草中超量表达并进行叶片组织向性生长测试。经10μM NAA处理后,超量表达GhABP1—C3S以及GhABP1—C63S植株叶片条的曲率均明显高于野生型,即表现出超量表达正常GhABP1烟草植株的特征。超量表达GhABP1—C157S植株的反应与野生型植株基本一致。157位半胱氨酸的突变导致了GhABP1功能的丧失,3、63位半胱氨酸的突变则没有降低GhABP1住高浓度NAA下的活性。不外加10μM NAA处理的情况下,GhABP1—C63S超量表达植株叶片曲率也明显超过了同样条件下的野生型植株;而GhABP1-C3S超量表达植株叶片曲率则不高于与相同条件下野生型植株相似。因此,第三位半胱氨酸的突变没有影响GhABP1的功能;第63位半胱氨酸的突变则是GhABP1对生长素的敏感度增加。5.超量表达GhABP1—C63S对植株表型的影响已经证实了63位半胱氨酸的突变将导致GhABP1在不外加生长素时的高活性。在植株表型的分析中也发现,超量表达GhABP1—C63S植株出现了特殊的表型,如植株明显发育迟缓,叶片变小缺乏光泽等。6.棉花生长素结合蛋白基因的表达分析在纤维不同发育时期,通过Northern杂交分析发现,GhABP1在棉纤维发育的9—20天有较高的表达量。表明GhABP1基因有可能参与了棉纤维发育的进程。