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DELLA蛋白位于植物细胞核中,在GA信号传导过程中起阻遏作用,还广泛参与植物光形态建成、环境信号传导和激素生长调节反应等生理过程。国内关于DELLA蛋白相关基因的研究起步较晚,但受到研究者的高度重视。近年来,获得了玉米GA受体基因、拟南芥DELLA下游的GASA基因家族、水稻SLR1基因、茄子SmGA噬因、海岛棉GhRGL(RGL-LIKE)基因等一批DELLA蛋白基因,并开展了载体构建、基因表达和功能分析等相关研究。目前,尚无枇杷DELLA蛋白相关基因的研究报道。本研究采用同源基因序列克隆方法对不同品种、同一品种不同倍性的枇杷进行DELLA基因克隆,再通过RACE扩增扩其全长,并进行序列比对分析。同时通过RT-PCR扩增对枇杷DELLA基因的表达进行初步分析。为继续开展枇杷DELLA蛋白的功能鉴定、时空表达分析等进一步研究奠定基础。本论文主要研究结果如下：(一)枇杷DNA和RNA提取方法改良利用CTAB改良方法Ⅰ、CTAB改良方法Ⅱ提取基因组DNA和改良CTAB-LiCl沉淀法提取RNA,提取的核酸质量较高,基本克服了多糖、多酚等杂质的影响,可以满足基本分子生物学实验的要求,保证后续试验的顺利进行。(二)枇杷1DELLA基因同源序列克隆1、利用正交试验设计筛选得到PrimeSTARTM HS DNA Polymerase特异引物PCR扩增产物的最优体系5×PrimeSTARTM Bufferd(含Mg2+) 3μL, dNTP Mixture (各10 mmol/L)1.6μL,上游引物(10 mmol/L)0.4μL,下游引物(10 mmol/L)0.4gL,模板DNA/cDNA (20ng/μL) 0.4μL, PrimeSTARTM HS DNA Polymerase (2.5 U/μL) 0.2μL,加灭菌去离子水补足20μL。2、根据GeneBank中登录的苹果DELLA蛋白基因序列设计了一对简并引物,对“大五星”(A)和“龙泉1号”(B)基因组进行PCR扩增克隆,得到长度都在700bp左右的片段,其中“大五星”条(暂命名为Sequence A1-A3,“龙泉1号”三条(暂命名为Sequence B1-B3), BLAST比对发现与苹果属DELLA基因的同源性达90%以上,全为外显子序列,无内含子。3、根据“龙泉1号Sequence B3设计特异引物,对“龙泉1号”二倍体、三倍体的gDNA和cDNA进行PCR扩增,得两条特异片段,片段长度都为731bp。通过BLAST比对,其中为一条与SequenceB3序列一致.另外一条与SequenceB3同源性达94%,存在单核苷酸变异,暂命名为SequenceB3a,经同源性比对均为DELLA基因片段。4、根据SequenceB3a基因序列片段设计RACE扩增引物进行RACE扩增,得到3’端464bp的序列,在Genbank上经过BLAST分析,发现该片段与苹果属MdRGL3a (GenBank登录号：DQ007887)同源性为97%,与MdRGL3b (GenBank登录号：DQ007888)同源性为92%,表明为DELLA同源基因序列。(三)枇杷DELLA基因序列分析1、比对枇杷不同品种的DELLA基因片段,发现”大五星”和”龙泉1号”6条序列彼此之间的同源性都超过60%。两个品种之间的3条DELLA基因序列都存在着多个核苷酸差异,而单个品种的3条基因序列之间也存在着核甘酸差异。2、比对枇杷同一品种不同倍性的DELLA基因片段,发现从“龙泉1号”二倍体gDNA中克隆得到SequenceB3和SequenceB3a两条序列,而cDNA中只克隆得至SequenceB3a。龙泉1号”三倍体gDNA和cDNA中都克隆得到这两个序列,据此推测二倍体中SequenceB3发生了基因沉默,而三倍体中均得到表达。3、将克隆得到的7条基因片段同Genebank上已经登录的蔷薇科苹果属DELLA蛋白基因序列一起构建分子进化树,发现该进化树分成三个大的进化分支,枇杷7条序列分散在其中。4、RACE扩增拼接得到“龙泉1号”SequenceB3a cDNA 3’端核甘酸序列,长度为1095 bp,包含终止密码子TAA,还包含了对应3’端的一段不翻译区。该序列的有效翻译区长度为915bp,翻译该DELLA蛋白C端序列304个氨基酸。分析发现枇杷DELLA蛋白C端氨基酸序列与其它已报道物种的DELLA基因高度同源,包含C端VHIID、RVER和SAW保守结构域。用BioEdit等软件对该序列编码蛋白结构与功能进行了预测。(四)枇杷DELLA同源基因表达的初步分析利用半定量RT-PCR的方法对“龙泉1号”二、三倍体的叶片和初花期、露白期、盛花期、花末期四个时期花器官1DELLA同源基因的表达进行了初步研究,结果表明,无论是二倍体还是三倍体DELLA基因在各个器官中都有表达,同一发育时期,三倍体中DELLA基因的表达水平比二倍体高。三倍体(?)DELLA基因在上述四个时期花器官的表达量逐渐增大。与二倍体相比,末花期DELLA蛋白表达明显增加。