研究背景骨性关节炎(osteoarthritis, OA)是中老年人中最常见的疾病。OA的典型病理改变是关节软骨的退变,包括纤维化、软骨厚度改变、软骨细胞排列紊乱和数量的减少。关节软骨的细胞外基质主要包括蛋白多糖和胶原,OA患者胞外基质合成-分解平衡的破坏是引起软骨降解的重要原因。一些研究表明,IL-1β、IFN-y和TNF-a等细胞因子能够抑制聚集蛋白聚糖(aggrecan)的合成,而aggrecan正是软骨中含量最多的一种蛋白多糖。因而,炎症因子在OA的发病中扮演着重要的角色。IL-18最初被认为是IFN-y的诱导因子,它的结构类似于IL-1。正常情况下,Kuffer细胞、巨噬细胞、角质形成细胞、树突细胞、星形细胞、小胶质细胞、呼吸上皮细胞、成骨细胞和软骨细胞等多种细胞均能产生无活性的IL-18前体。像IL-1β一样,IL-18以无活性的前体形式合成,在IL-1p转化酶的作用下发生裂解。氧化应激或者蛋白脂多糖刺激半胱天冬酶-1途径后,成熟IL-18的产生会大量增加。IL-18诱导Fas配体、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs)和一些炎性蛋白的产生。有人报道IL-18能够促进多种炎症因子的表达,如：IFN-γ、粒细胞集落刺激因子、TNF-α和IL-1β,导致一系列炎性疾病的发展,如：肠道疾病、特异性皮炎、哮喘、间质性肺炎和慢性阻塞性肺疾病(COPD)等。近年来的研究发现,IL-18在类风湿关节炎(rheumatoid athritis, RA)的发病过程中有重要的作用。IL-18在RA患者的滑液中表达增高,同时,OA患者滑液及滑膜中亦能检测到IL-18的受体的表达,减少滑膜中巨噬细胞的数量能够抑制软骨的降解和骨赘的形成。免疫组化染色发现OA软骨中亦有IL-18的表达,IL-18诱导软骨细胞凋亡。本题的前期研究证实,体外培养的OA滑膜细胞上清液中,IL-18和PGE2的浓度具有相关性。较正常的滑膜细胞,OA滑膜细胞能够产生高水平的IL-18。然而,IL-18对滑膜细胞、软骨细胞以及膝关节退变的影响尚不清楚。本研究旨在探讨高浓度IL-18对软骨细胞和滑膜细胞的促炎作用,以及对关节软骨的影响。目的1.观察IL-18对软骨细胞增殖的影响2.探讨重组人IL-18(hrIL-18)对人软骨细胞、滑膜细胞炎症应答,以及对细胞外基质合成的影响3.应用重组大鼠IL-18(rrIL-18)初步建立OA动物模型,探讨IL-18对膝关节软骨的影响方法1.人OA软骨细胞的分离与培养取膝骨性关节炎关节置换术中取下的股骨髁、胫骨平台,在无菌条件下,以手术刀片小心切取关节面软骨,将软骨组织切成0.5-1mm3的小块,0.2%的Ⅱ型胶原酶和0.1%的透明质酸酶37℃恒温消化6h。无菌细胞筛过滤,并收集软骨细胞转移至25cm培养瓶,置于37℃、5%CO2的恒温培养箱进行原代培养。细胞生长至80%左右,接近融合传代,第2代之前的细胞用作后续实验。应用倒置相差显微镜观察细胞的形态、分布及生长状态,采集图像。收集第1、2代软骨细胞接种至96孔板,应用MTT法检测细胞的增殖情况,并绘制生长曲线。采用免疫组化的方法检测软骨细胞中Ⅱ型胶原的表达。2.人OA滑膜细胞的培养无菌PBS洗涤滑膜组织两次,将滑膜组织剪碎,成糊状。0.1%的胰蛋白酶消化组织30分钟,含0.1%Ⅰ型胶原酶的培养基消化组织2h。无菌细胞筛过滤,离心,收集细胞。加入含有10%胎牛血清的培养基和双抗,进行原代细胞的贴壁培养。免疫组化和流式细胞术分别检测Ⅰ型胶原和VCAM-1的表达。3. rhIL-18对OA软骨细胞和滑膜细胞的影响(1) rhIL-18对软骨细胞增殖的影响收集软骨细胞接种至96孔板,分别加入不同浓度的rhIL-18(0.50.150.300ng/ml).50ng/ml的TGF-P.50ng/ml IL-18+TGF-β,孵育48h,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞的增殖。(2)细胞干预和RT-PCR检测软骨细胞接种于6孔板中,加入不同浓度rhIL-18(0.50.150.300ng/ml)共同孵育48h。等量的第1代(G1)、第2代(G2)和第3代(G3)滑膜细胞在无血清DMEM中饥饿24h,加入含IL-18(10mM/ml)的培养基孵育24h,收集细胞和上清液。提取细胞的总RNA,RT-PCR检测软骨细胞炎症因子、Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖以及滑膜细胞炎症因子mRNA的表达。以GAPDH为内对照,分析mRNA的相对表达量。(3)细胞培养上清液中PGE2、TNF-a和MMP-13浓度的测定软骨细胞接种于6孔板中,培养12h后,加入不同浓度rhIL-18(0.50.150.300ng/ml)共同孵育48h。等量的第1代(G1)、第2代(G2)和第3代(G3)滑膜细胞在无血清DMEM中饥饿24h,加入含IL-18(10mM/ml)的培养基孵育24h,收集细胞。收集细胞培养上清液,酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测PGE2、TNF-a和MMP-13的浓度。(4) RT-PCR方法检测软骨细胞和滑膜细胞中IL-18受体的表达。4.rrIL-18诱导大鼠膝关节退变(1)分组和干预20只SD大鼠左侧膝关节注射rrIL-18(200ng)作为实验组,对侧注射等量PBS溶液作为对照组。6周、12周后,各有一半样本进入指标检测。(2)大鼠膝关节X线表现大鼠麻醉后固定于泡沫板上,行双侧膝关节X线检查。采集图像,两名独立的观察者评价膝关节的退变情况。(3)膝关节组织病理学观察颈椎脱臼法处死大鼠,取膝关节作为检测样本。剔除关节周围的软组织,多聚甲醛固定、脱钙、石蜡包埋、5μm切片后,番红O/快绿染色。采集切片的图像后,应用IPP软件计算两组样本软骨的面积。(4)脱钙后的关节标本行石蜡切片,应用免疫组化的方法检测关节软骨中COX-2和Aggrecan的表达。结果1.OA软骨细胞的体外培养及鉴定(1)软骨细胞形态学观察原代软细胞形状不规则,多呈短椭圆形,部分呈星形和多角形。传3代后,细胞形态发生改变,呈长梭形。(2)软骨细胞增殖随着时间的增长,细胞数目不断增加(P<0.01),直到第10d左右进入平台期。同一时间,第1、2代细胞的数目无明显差异(P=0.939),时间与代次之间无明显的交互作用(P=0.577)。(3)免疫组化染色所有细胞Ⅱ型胶原的免疫组化染色为阳性。2.OA滑膜细胞的体外培养及鉴定(1)滑膜细胞形态学观察A型滑膜细胞呈多边形,B性滑膜细胞呈长梭形。随着代次增加,B型滑膜细胞的比例增加。(2)滑膜细胞增殖随着时间的增长,细胞数目不断增加(P<0.01),直到第4d左右进入平台期。同一时间,第1-3代细胞的数目无明显差异(P>0.05),时间与代次之间无显著的交互作用(P=0.987)。(3)免疫组化染色和FCM检测所有细胞Ⅰ型胶原的免疫组化染色为阳性,细胞表面VCMA-1的表阳性。3. rhIL-18诱导炎症因子的分泌并抑制软骨基质的合成(1) rhIL-18对软骨细胞增殖的影响孵育48h后,不同浓度的rhIL-18(0、50、150和300ng/ml)对软骨细胞数目无显著影响(P>0.05)。相比较对照组,TGF-β+IL-18组和TGF-β组细胞数显著增加(P，0.001,P=0.016)。TGF-β+IL-18组细胞数低于TGF-β组(P=0.002)。(2)rhIL-18抑制软骨细胞产生aggrecan,促进炎症因子的表达与对照组相比,300ng/ml组Aggrecan的表达显著降低(P=0.008)。但是,各组细胞collagen II的表达量无统计学差异(P>0.05)。rhIL-18促进软骨细胞分泌COX-2和TNF-a,并具有浓度依赖效应。300ng/ml组COX-2mRNA的表达显著高于对照组(0ng/ml组)和150ng/ml组(P=0.006和P=0.036)。与对照组(0ng/ml组)相比较,150ng/ml组和300ng/ml组TNF-a的mRNA的表达显著增高(P=0.001和P=0.023)。IL-18上调G1滑膜细胞中COX-2和TNF-a mRNA的表达。(3)细胞培养上清液中PGE2、TNF-a和MMP-13浓度测定随着rhIL-18浓度的增加,上清液中PGE2和TNF-a的含量显著增加(P<0.001).50ng/ml组PGE2的水平与对照组(0ng/ml组、300ng/ml组有统计学差异(P=0.001和P=0.001)。150ng/ml组TNF-a的浓度与对照组(0ng/ml组)、300ng/ml组有统计学差异(P<0.001和P=0.001)。然而,在不同浓度rhIL-18干预下,MMP-13的含量无显著性差异(P>0.05)。G1滑膜细胞中,IL-18组PGE2和TNF-a的浓度显著高于对照组(P=0.005,P=0.007)。4. rrIL-18诱导大鼠关节软骨的基质降解和炎症反应(1)大鼠膝关节中IL-18的水平实验组和对照组膝关节中IL-18的浓度分别为464.64±31.26pg/ml和15.26±1.62pg/ml,二者有统计学差异(P=0.002)。(2)大鼠膝关节X线表现6周后,实验组2例膝关节出现关节间隙变窄或者骨赘形成,而对照组仅有1例出现关节间隙变窄。两组退变发生率无统计学差异(P>0.05)。12周后,实验组中5个膝关节出现膝关节间隙变窄或者骨赘形成,对照组未见异常膝关节改变。两组退变发生率有显著差异(P=0.033)。(3)大鼠膝关节软骨组织病理学检测对照组股骨髁的面积为4.01±1.12mm2,实验组股骨髁软骨的面积为3.45±1.08mm2。两组软骨面积有统计学差异,后者显著减小(P=0.035)。(4)大鼠膝关节软骨免疫组化检测12周后,与对照组相比,实验组股骨髁软骨中Aggrecan的表达量显著降低(P=0.021)。两组胫骨平台软骨中,Aggrecan的表达也有明显的不同(P=0.047)。无论是在股骨髁还是胫骨平台的软骨中,实验组COX-2的表达量均显著高于对照组(P=0.002,P=0.032)。结论1.IL-18不影响软骨细胞的增殖,但是能够抑制TGF-β对细胞增殖的促进作用。2.IL-18诱导软骨细胞和滑膜细胞的炎症应答,抑制软骨基质的合成。3.膝关节内高水平的IL-18通过促进软骨分泌炎症因子和和抑制软骨成分的产生诱导关节退变。